IL-38表达与AD相关性分析
探究IL-38在皮肤中的表达及其与AD发生发展的关系。
利用HPA数据库分析IL-38在人组织中的表达，GEO数据集分析AD患者皮肤中IL-38表达，构建DNFB诱导AD模型，通过IHC、RT-qPCR、Western blot检测IL-38表达。
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IL-38通过促进朗格汉斯细胞迁移加重特应性皮炎
IL-38 Aggravates Atopic Dermatitis via Facilitating Migration of Langerhans cells.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、DNFB诱导AD模型、体外BM-LCs细胞实验、信号通路抑制剂验证、体内抑制剂治疗实验等多层级功能验证与机制验证。
主要模型
K14Cre/+-IL-38f/f小鼠 IL-38f/f小鼠 DNFB诱导的AD小鼠模型 小鼠骨髓来源的LC样细胞(BM-LCs)
重点核对
角质形成细胞特异性敲除IL-38对皮肤屏障和免疫的影响 DNFB诱导AD模型的方案(0.5%致敏和0.2%激发) rmIL-38皮下注射剂量(1 mg/kg)和给药方案 IRAK4抑制剂Zimlovisertib的给药方式(TDDs或口服)和剂量 LC迁移检测方法(FITC涂抹和Transwell实验)
摘要
特应性皮炎(AD)是一种常见的炎症性皮肤病，涉及免疫细胞和角质形成细胞之间的失调相互作用。白细胞介素-38(IL-38)是一种了解甚少的IL-1家族细胞因子，其在AD发病机制中的作用和机制尚不清楚。在此，我们表明IL-38主要由表皮角质形成细胞分泌，在皮肤中高表达，并在AD病变中下调。我们生成了IL-38角质形成细胞特异性敲除小鼠(K14Cre/+-IL-38f/f)，并通过2,4-二硝基氟苯(DNFB)诱导AD模型。出乎意料的是，在DNFB处理后，K14Cre/+-IL-38f/f小鼠对AD的皮肤炎症敏感性较低。此外，角质形成细胞特异性缺失IL-38抑制了朗格汉斯细胞(LCs)向淋巴结的迁移，导致CD4+T细胞分化紊乱，并减少了免疫细胞向AD病变的浸润。LCs是一种树突状细胞，特异性存在于表皮中并调节免疫反应。我们在体外从小鼠骨髓(BM)中开发了LC样细胞，并用重组IL-38处理。结果表明，IL-38依赖于IL-36R，激活IRAK4和NF-κB P65的磷酸化表达，并上调CCR7的表达以促进LCs的迁移，然而，这种上调在加入IL-36受体拮抗剂(IL-36RA)、IRAK4或NF-κB P65抑制剂后消失。此外，在IRAK4抑制剂处理后，实验性AD表型得到缓解，因此IRAK4被认为是治疗炎症性疾病的有前景的靶点。总之，我们的研究结果表明，IL-38依赖于IL-36R，通过IRAK4/NF-κB上调CCR7，促进LCs迁移从而促进AD，并暗示了AD的预防和治疗，支持IRAK4抑制剂在AD治疗中的潜在临床应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IL-38在特应性皮炎发病中的作用和机制是什么？
- 核心机制
- IL-38依赖于IL-36R，激活IRAK4/NF-κB信号通路，上调CCR7表达，促进朗格汉斯细胞向淋巴结迁移，进而影响CD4+T细胞分化，加重AD。
- 主要证据
- IL-38角质形成细胞特异性敲除小鼠在DNFB诱导下皮炎症状减轻，LCs迁移减少；体外BM-LCs实验证明IL-38通过IL-36R/IRAK4/NF-κB上调CCR7；IRAK4抑制剂可缓解AD症状。
- 研究意义
- 揭示IL-38和IRAK4在AD发病中的重要性，为理解AD机制和开发临床治疗药物提供新见解，支持IRAK4抑制剂在AD治疗中的潜在应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IL-38角质形成细胞特异性敲除小鼠的构建与表型分析
验证敲除效率和稳态下皮肤屏障及免疫的影响。
通过Cre-loxP系统生成K14Cre/+-IL-38f/f小鼠，RT-qPCR和Western blot确认敲除，通过甲苯胺蓝染色和TEWL评估屏障功能，流式细胞术检测免疫细胞。
DNFB诱导AD模型评估IL-38敲除的影响
确定角质形成细胞IL-38缺失对AD样皮肤炎症的影响。
对K14Cre/+-IL-38f/f和IL-38f/f小鼠进行DNFB诱导，评估皮炎评分、表皮厚度、血清IgE、肥大细胞数量、炎症细胞因子表达和免疫细胞浸润。
IL-38对LCs迁移和T细胞分化的影响
探究IL-38是否通过影响LCs迁移进而影响T细胞分化。
流式细胞术检测淋巴结中Th1/Th2细胞、皮肤和淋巴结中DC亚群，FITC涂抹检测LCs迁移。
体外验证IL-38对LCs迁移和CCR7表达的影响
验证IL-38是否直接趋化LCs或通过上调CCR7促进迁移。
诱导BM-LCs，Transwell实验检测IL-38趋化性和CCL21诱导的迁移，RT-qPCR和流式检测CCR7表达。
信号通路机制验证
验证IL-38是否通过IL-36R/IRAK4/NF-κB通路调控CCR7。
BM-LCs中加入rmIL-38、IL-36Ra、IRAK4抑制剂Zimlovisertib或NF-κB抑制剂QNZ，检测CCR7表达和蛋白磷酸化。
体内抑制剂治疗效果评估
评估IRAK4抑制剂对DNFB诱导AD的治疗作用。
DNFB诱导AD小鼠，经皮或口服给予Zimlovisertib或QNZ，评估皮炎评分、炎症因子、免疫细胞浸润和T细胞分化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | IL-38-floxed小鼠 | Cyagen Biosciences Inc. | -- |
| Krt14-Cre小鼠 | Nanjing Biomedical Research Institute of Nanjing University | J004782 | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | 219 |
| 基因分型 | 基因组DNA提取试剂盒 | Bimake | B40015 |
| AD诱导 | 重组小鼠IL-38蛋白 | Adipogen | AG-40B-0101-C010 |
| 皮肤屏障功能检测 | GPSkin经皮水分丢失测量仪 | GPOWER | -- |
| 组织染色 | 甲苯胺蓝 | -- | -- |
| 图像采集 | 奥林巴斯BX600显微镜 | Olympus Corporation | -- |
| SPOT Flex相机 | Olympus Corporation | -- | |
| 图像分析 | ImagePro Plus软件 | Media Cybernetics | -- |
| 免疫组化 | IL-38抗体 | Abcam | ab180898 |
| DAB底物试剂盒 | ZSGB-BIO | ZLI-9017 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 反转录 | PrimeScript RT试剂盒(含gDNA Eraser) | Takara Bio | RR047A |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq II试剂 | Takara Bio | RR820 |
| LightCycler96 PCR仪 | Roche | -- | |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | CST | 4970s | |
| 小鼠IL-38抗体 | R&D Systems | MAB7774 | |
| IRAK4抗体 | CST | 4363s | |
| 磷酸化IRAK4抗体 | CST | 11927s | |
| NF-κB p65抗体 | CST | 8242s | |
| 磷酸化NF-κB p65抗体 | CST | 3033s | |
| 剥离缓冲液 | Beyotime | P0025 | |
| 山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A27036 | |
| ECL化学发光试剂 | Merck Millipore | WBKLS0500 | |
| 流式细胞术 | RPMI培养基 | Gibco | -- |
| Liberase酶 | Roche | -- | |
| DNase酶 | Roche | -- | |
| gentleMACS组织处理器 | Miltenyi Biotech | -- | |
| 40 μm细胞过滤器 | BD Bioscience | 352340 | |
| 70 μm细胞过滤器 | BD Bioscience | 352350 | |
| NovoCyte流式细胞仪 | ACEA Biosciences | -- | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| CD45-BV510抗体 | -- | 1033137 | |
| CD11b-APC抗体 | eBioscience | 17-0112-82 | |
| CD11c-APC/Cyanine7抗体 | -- | 117324 | |
| MHCII-FITC抗体 | eBioscience | 11-5322-81 | |
| CD64-PE/Cyanine7抗体 | -- | 139314 | |
| Gr-1-PE/Cyanine7抗体 | -- | 108416 | |
| CD207-PE抗体 | -- | 144204 | |
| CCR7-APC抗体 | -- | 120108 | |
| F4/80-FITC抗体 | -- | 123108 | |
| EPCAM-PE/Cyanine7抗体 | eBioscience | 25-5791-80 | |
| Siglec-F-FITC抗体 | -- | 155504 | |
| CD49bPE/Dazzle594抗体 | -- | 108923 | |
| FcεRIα-PE抗体 | -- | 134308 | |
| CD3-APC/Cyanine7抗体 | -- | 100222 | |
| CD4-PerCP/Cy5.5抗体 | -- | 100434 | |
| CD8-PE/Cyanine7抗体 | -- | 100722 | |
| IFN-γ-FITC抗体 | -- | 505806 | |
| 7-AAD染液 | -- | 420404 | |
| ELISA | 小鼠IgE ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EMC117.96 |
| FITC迁移实验 | 异硫氰酸荧光素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | Sigma-Aldrich | -- | |
| BM-LCs诱导 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 重组小鼠GM-CSF | Peprotech | -- | |
| 重组人TGFβ1 | Peprotech | -- | |
| 体外刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 重组小鼠IL-36Ra | Peprotech | 210-36RA | |
| QNZ (NF-κB抑制剂) | Selleck | S4902 | |
| Zimlovisertib (IRAK4抑制剂) | Selleck | S8531 | |
| Transwell迁移 | 24孔Transwell板(8 μm孔径聚碳酸酯膜) | Corning | -- |
| 重组小鼠CCL21 | Peprotech | 250-13 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6背景，IL-38f/f和K14Cre/+-IL-38f/f；Krt14-Cre小鼠来源；饲养条件 阅读提示：Materials and Methods: Animals |
| AD诱导 | DNFB浓度：0.5%致敏、0.2%激发；溶剂：丙酮/橄榄油(4:1)；致敏和激发时间点 阅读提示：Materials and Methods: DNFB-induced AD-like skin inflammation model |
| 药物处理 | rmIL-38皮下注射剂量：1 mg/kg；注射时间和频率：从第5天开始，每两天一次，共15天 阅读提示：Materials and Methods: DNFB-induced AD-like skin inflammation model |
| 抑制剂治疗 | Zimlovisertib剂量：经皮20 mg/kg，口服10 mg/kg；QNZ剂量：经皮2 mg/kg，口服1 mg/kg；给药方式：TDDs或口服；开始时间：第6天 阅读提示：Materials and Methods: Inhibitors treatment assay in AD |
| LC迁移检测 | FITC浓度：1% (w/v)；溶剂：丙酮:邻苯二甲酸二丁酯(1:1)；处理时间：72小时 阅读提示：Materials and Methods: FITC painting and in vivo LCs migration assay |
| BM-LCs诱导和体外刺激 | 细胞因子：GM-CSF 20 ng/ml, TGFβ1 10 ng/ml；刺激时间：7天；刺激物浓度：rmIL-38 100 ng/mL, LPS 100 ng/mL, rmIL-36Ra 100 ng/mL, Zimlovisertib 100 nM, QNZ 10 μM 阅读提示：Materials and Methods: Induction of BM-derived LC-like cells and stimulation assays in vitro |