鉴定USP1相互作用蛋白
筛选USP1在CCA中的潜在底物
在RBE细胞中稳定过表达USP1，进行蛋白质组学和泛素化组学分析，筛选出上调且泛素化水平降低的蛋白，并通过CO-IP验证与USP1的相互作用。
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USP1通过去泛素化PARP1阻止其蛋白酶体降解促进胆管癌进展
USP1 promotes cholangiocarcinoma progression by deubiquitinating PARP1 to prevent its proteasomal degradation.
实验完整度
高包含细胞功能实验（增殖、侵袭、凋亡）、体内动物模型（移植瘤、肺转移）、分子机制验证（CO-IP、GST pull-down、去泛素化实验）及临床样本关联分析（免疫印迹、免疫组化、生存分析）。
主要模型
胆管癌细胞系HuCC-T1、HCCC-9810、RBE HEK-293T细胞 BALB/c裸鼠移植瘤模型 BALB/c小鼠肺转移模型 胆管癌患者组织样本（n=65）
重点核对
USP1和PARP1蛋白在细胞系中的表达及相互作用 USP1对PARP1蛋白稳定性的调控，包括MG132、CHX处理 USP1去泛素化PARP1的特异性位点（K197）和连接类型（K48） GCN5对USP1的乙酰化修饰（K130）及其对PARP1稳定性的影响 体内实验：细胞注射数量（2.5×10^6）、小鼠品系（BALB/c）和分组
摘要
尽管USP1在多种癌症中发挥作用，但去泛素化酶USP1（泛素特异性蛋白酶1）在胆管癌（CCA）中的功能尚未被探索。在本研究中，我们提供证据表明USP1通过稳定聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）促进CCA进展，这与在人类CCA中观察到USP1和PARP1均上调一致。对USP1过表达的CCA细胞进行蛋白质组学和泛素化组学分析，将PARP1列为USP1的首要底物。实际上，通过一系列免疫荧光、免疫共沉淀（CO-IP）和GST pull-down实验验证了它们的直接相互作用，并使用缺失突变体鉴定了它们的相互作用区域。机制上，USP1去除PARP1 K197位的泛素链以防止其蛋白酶体降解，随之而来的PARP1稳定化对于在体外和体内促进CCA的生长和转移是必要且充分的。此外，我们鉴定乙酰转移酶GCN5在K130位乙酰化USP1，增强USP1与PARP1之间的亲和力，并进一步增加PARP1蛋白的稳定化。最后，USP1和PARP1均与CCA患者的不良生存显著相关。这些发现将PARP1描述为USP1的一个新型去泛素化靶点，以及CCA的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- USP1在胆管癌中的功能及其调控PARP1的分子机制是什么？
- 核心机制
- GCN5在K130位乙酰化USP1，增强USP1与PARP1的亲和力；USP1去除PARP1 K197位的K48连接泛素链，阻止其蛋白酶体降解，稳定PARP1蛋白，进而促进CCA增殖、侵袭和转移。
- 主要证据
- 通过CO-IP、GST pull-down、免疫荧光和PLA验证USP1与PARP1直接相互作用；体内外泛素化实验证明USP1去泛素化PARP1；细胞功能实验和动物模型显示USP1通过PARP1促进增殖、侵袭和转移；临床样本分析显示USP1和PARP1表达正相关且与不良生存相关。
- 研究意义
- 揭示PARP1为USP1的新型去泛素化靶点，为胆管癌治疗提供潜在的治疗靶点，并可能为开发针对USP1/PARP1的靶向治疗开辟新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证USP1与PARP1的直接相互作用
确认USP1与PARP1之间的物理结合
在多种细胞系（HuCC-T1, HCCC-9810, RBE, HEK-293T）中进行CO-IP、免疫荧光共定位、PLA和GST pull-down实验，并使用截短突变体定位相互作用区域。
检测USP1对PARP1蛋白稳定性的影响
验证USP1是否通过抑制降解稳定PARP1蛋白
通过过表达或敲低USP1，结合MG132、CQ和CHX处理，检测PARP1蛋白水平及mRNA水平，并进行回补实验验证催化活性依赖性。
阐明USP1去泛素化PARP1的机制
确定USP1去除PARP1泛素链的具体位点和类型
通过体内泛素化实验、体外去泛素化实验，结合泛素突变体（K48、K63等），确定USP1特异性地去除PARP1 K197位的K48连接泛素链。
评估USP1-PARP1轴在细胞功能中的作用
验证USP1通过稳定PARP1促进CCA细胞的增殖、侵袭和转移
在CCA细胞中敲低或过表达USP1，并回补或敲低PARP1，进行克隆形成实验、Transwell实验和凋亡检测。
验证USP1-PARP1轴在体内肿瘤生长和转移中的作用
在动物模型中验证USP1通过PARP1促进CCA体内生长和转移
将稳定表达相应质粒的HuCC-T1或RBE细胞皮下注射或尾静脉注射到BALB/c小鼠，观察肿瘤生长和肺转移情况。
探究GCN5乙酰化USP1的调控机制
明确GCN5是否通过乙酰化USP1增强其去泛素化活性
通过CO-IP筛选乙酰转移酶，验证GCN5与USP1相互作用，并使用GCN5抑制剂或过表达、以及USP1 K130突变体，检测USP1乙酰化水平及其对PARP1稳定性的影响。
评估USP1和PARP1在临床样本中的相关性及预后价值
研究USP1和PARP1在CCA患者中的表达相关性及其与预后的关系
通过免疫印迹和IHC检测CCA组织中USP1和PARP1的表达，进行相关性分析，并采用Kaplan-Meier生存分析评估其与总生存期的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | SH30284.01 |
| 胎牛血清 | Gibgo | 10099 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000075 |
| 质粒构建 | pcDNA3.1载体 | Addgene | 37680 |
| pGEX-4T-1载体 | Addgene | 129567 | |
| 慢病毒感染 | Plvx-Puro载体 | Biobw | Bio-114923 |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| PVDF膜 | ThermoFisher Scientific | PB9220 | |
| 化学发光试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 89880 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | ThermoFisher Scientific | 15596026CN |
| 一步法SYBR Green RT-qPCR试剂盒 | ThermoFisher Scientific | QR0100 | |
| 免疫组化 | 柠檬酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | C9999 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A1595 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 85111 |
| DAPI染液 | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 邻位连接技术 | Duolink PLA试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO92002-30RXN, DUO92004-30RX |
| Lab-Tek II腔室载玻片 | Nunc | 154534 | |
| 脱脂奶粉 | BD Biosciences | 232100 | |
| CO-IP | Protein A/G琼脂糖珠 | ThermoFisher Scientific | 80105G |
| Tris缓冲盐溶液 | ThermoFisher Scientific | R017R.0000 | |
| 吐温-20 | ThermoFisher Scientific | 85113 | |
| 2x Laemmli缓冲液 | Sigma-Aldrich | S3401-10VL | |
| 抗MYC琼脂糖珠 | ThermoFisher Scientific | 20168 | |
| 抗HA磁珠 | ThermoFisher Scientific | 88836 | |
| GST pull-down | 大肠杆菌BL21 (DE3) | ThermoFisher Scientific | EC0114 |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | ThermoFisher Scientific | 34060 | |
| GST标签纯化树脂 | Roche | 08778850001 | |
| BeyoGold GST标签纯化树脂 | Beyotime | P2251 | |
| 去泛素化实验 | MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 |
| Pierce c-Myc肽 | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| Pierce IP裂解缓冲液 | ThermoFisher Scientific | 87788 | |
| HA合成肽 | ThermoFisher Scientific | 26184 | |
| K48连接的二泛素 | KS-V Peptide | U2701 | |
| Tricine样品缓冲液 | Bio-Rad | -- | |
| Tris-Tricine凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞处理 | MB-3（GCN5抑制剂） | Sigma-Aldrich | M2449 |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6629 | |
| 质谱分析 | timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 356234 |
| Transwell小室 | Falcon | 353097 | |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | 548-62-9 | |
| 克隆形成实验 | 吉姆萨染液 | Sigma-Aldrich | 51811-82-6 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | NEOBIOSCIENCE | FAK012.20 |
| Guava easyCyte HT流式细胞仪 | Millipore | -- | |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Shanghai Model Organisms Center | -- |
| 福尔马林 | Sigma-Aldrich | 15512-1L-R |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基条件（DMEM+10%FBS）、培养环境（37°C, 5% CO2）、STR鉴定和支原体检测 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and tissue samples |
| USP1-PARP1相互作用验证 | 细胞系（HuCC-T1, HCCC-9810, RBE, HEK-293T）、抗体、Co-IP流程、GST pull-down条件 阅读提示：Materials and methods: CO-IP, GST pull-down; Figure legends 1 |
| 蛋白稳定性检测 | MG132浓度（20 μM）和处理时间（8小时）、CQ浓度（25 μM）和处理时间（2小时）、CHX浓度（50 μg/ml）和时间点 阅读提示：Materials and methods: 免疫印迹；Figure legends 2 |
| 去泛素化实验 | MG132处理条件、His-Ub突变体（K48, K63等）、PARP1-K197R突变体、体外反应缓冲液及孵育条件（37°C, 2小时） 阅读提示：Materials and methods: In vivo and in vitro deubiquitination assay; Figure legends 3 |
| 细胞功能实验 | 克隆形成细胞数（500/孔）、培养时间（2周）、Transwell细胞密度（2.5×10^5/mL）和孵育时间（24小时）、凋亡检测细胞密度（5×10^5/mL） 阅读提示：Materials and methods: Cell clone assay, Transwell assay, Apoptosis assay; Figure legends 4 |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c）、周龄（6周）、每组数量（6只）、注射细胞数（2.5×10^6）、肿瘤测量频率（每3天）和持续时间（4周）、尾静脉注射细胞数（2.5×10^6） 阅读提示：Materials and methods: Animal experiment; Figure legends 4 |
| 乙酰化实验 | TSA（0.5 μM, 16小时）和NAM（5 mM, 4小时）浓度及处理时间、GCN5抑制剂MB-3浓度、USP1 K130突变体 阅读提示：Materials and methods: 细胞处理；Figure legends 5 |
| 临床样本分析 | CCA组织样本数量（n=28和n=65）、免疫组化评分方法、Kaplan-Meier生存分析分组 阅读提示：Materials and methods: 临床样本收集和IHC；Figure legends 6 |