体外验证VX765抑制NLRP3炎症小体激活
评估VX765对LPS和ATP诱导的巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活的影响。
使用WT、ApoE−/−和Ldlr−/−来源的BMDM以及J774A.1细胞，经LPS和ATP处理，VX765处理后检测caspase 1激活、IL-1β释放及ASC释放。
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caspase 1抑制剂VX765通过促进线粒体自噬和胞葬作用抑制NLRP3炎症小体组装和动脉粥样硬化的新作用
Novel role for caspase 1 inhibitor VX765 in suppressing NLRP3 inflammasome assembly and atherosclerosis via promoting mitophagy and efferocytosis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HEK293T重构、巨噬细胞处理）、体内动物模型（Ldlr−/−和ApoE−/−小鼠）及基因敲除验证（Nlrp3−/−;ApoE−/−），明确功能与机制验证。
主要模型
RAW264.7巨噬细胞 J774A.1巨噬细胞 骨髓来源巨噬细胞（BMDM） Ldlr−/−和ApoE−/−小鼠动脉粥样硬化模型
重点核对
VX765以剂量依赖方式抑制caspase 1激活，浓度0、7、14、28μg/mL，处理2小时 体内VX765给药剂量为75mg/kg，每周3次腹腔注射，溶剂为20%蓖麻油 Nlrp3−/−;ApoE−/−小鼠可废除VX765的抗动脉粥样硬化作用 LPS（100ng/mL，8h）和ATP（5mM，1h）诱导NLRP3炎症小体激活
摘要
动脉粥样硬化是一种适应不良的慢性炎症性疾病，仍然是世界范围内导致死亡的主要原因。NLRP3炎症小体是动脉粥样硬化的主要驱动因素，但其作用机制尚不清楚。线粒体功能障碍是NLRP3炎症小体激活所必需的。然而，活化的NLRP3炎症小体是否加剧线粒体功能障碍仍有待进一步阐明。在此，我们试图应用VX765（一种公认的caspase 1抑制剂）来解决这些问题。VX765强效抑制caspase 1介导的IL-1β产生和gasdermin D加工。我们的研究赋予了VX765拮抗NLRP3炎症小体组装和激活的新作用。VX765减轻由活化的NLRP3炎症小体诱发的线粒体损伤，表现为线粒体ROS产生减少和线粒体DNA向胞质的释放减少。VX765阻断caspase 1依赖性剪切，并促进线粒体Parkin的募集和磷酸化，而Parkin是线粒体自噬的关键调节因子。在功能上，VX765促进巨噬细胞的线粒体自噬、胞葬作用和M2极化。它还抑制巨噬细胞的泡沫细胞形成、迁移和焦亡。在ApoE−/−和Ldlr−/−小鼠中，VX765增强自噬，促进胞葬作用，并减轻血管炎症和动脉粥样硬化。然而，在ApoE−/−小鼠中敲除Nlrp3后，VX765的这些效应被消除。这项工作为NLRP3炎症小体组装及其在决定动脉粥样硬化中的作用提供了机制见解。该研究强调，操纵caspase 1为治疗动脉粥样硬化性心血管疾病开辟了新途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- VX765是否通过调节NLRP3炎症小体组装和线粒体自噬来影响血管炎症和动脉粥样硬化？
- 核心机制
- VX765通过抑制caspase 1活性，阻断caspase 1对Parkin的剪切，促进Parkin线粒体易位和磷酸化，增强线粒体自噬，减轻线粒体损伤，从而抑制NLRP3炎症小体组装和激活，促进巨噬细胞胞葬作用和M2极化，减轻动脉粥样硬化。
- 主要证据
- 体外实验显示VX765抑制NLRP3寡聚化和ASC寡聚化，减少IL-1β释放和GSDMD剪切；体内ApoE−/−和Ldlr−/−小鼠模型显示VX765减小动脉粥样硬化斑块面积和坏死核心；Nlrp3基因缺失后VX765的效应消失。
- 研究意义
- 该研究为NLRP3炎症小体组装机制及其驱动动脉粥样硬化提供新见解，提示抑制caspase 1可能为治疗动脉粥样硬化性心血管疾病提供新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证VX765抑制NLRP3炎症小体组装
确定VX765是否阻断NLRP3和ASC的寡聚化及相互结合。
通过SDD-AGE检测NLRP3寡聚化，ASC寡聚化实验检测ASC聚合，免疫共沉淀检测NLRP3-ASC和ASC-procaspase 1相互作用。
检测VX765对线粒体损伤和线粒体自噬的影响
探讨VX765是否减轻NLRP3炎症小体激活诱导的线粒体损伤并促进线粒体自噬。
检测mROS、线粒体膜电位、mtDNA释放、Parkin磷酸化及线粒体转位，以及Parkin的剪切。
验证VX765对巨噬细胞焦亡的影响
评估VX765是否抑制NLRP3炎症小体激活引发的细胞焦亡。
PI/Hoechst染色检测膜完整性，LDH释放检测，GSDMD剪切检测。
验证VX765对巨噬细胞功能的影响
考察VX765是否影响泡沫细胞形成、迁移、极化及胞葬作用。
油红O染色检测泡沫细胞形成，划痕实验检测迁移，流式/RT-qPCR检测M2标记物，凋亡细胞吞噬实验评估胞葬作用。
体内验证VX765对动脉粥样硬化的影响
评估VX765对高脂饮食诱导的小鼠动脉粥样硬化和血管炎症的作用。
对Ldlr−/−和ApoE−/−小鼠给予VX765，检测主动脉斑块面积、坏死核心、炎症因子表达和巨噬细胞浸润。
验证NLRP3依赖性
证实VX765的效应依赖于NLRP3。
使用Nlrp3−/−;ApoE−/−小鼠重复VX765处理，检测动脉粥样硬化病变和炎症指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FastStart Universal SYBR Green预混液 | Roche Applied Science | -- | |
| 免疫印迹 | 抗NLRP3抗体 | AdipoGen | AG-20B-0014-C100 |
| 抗ASC抗体 | AdipoGen | AG-25B-0006 | |
| 抗caspase 1抗体 | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| 抗白细胞介素-1β抗体 | R&D Systems | AF-401-NA | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗HA抗体 | Biolegend | 901501 | |
| 抗myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| 抗gasdermin D抗体 | Abcam | ab209845 | |
| 抗ABCA1抗体 | Abcam | ab18180 | |
| 抗CD36抗体 | Novus Biologicals | NB400-144 | |
| 抗Parkin抗体 | Cell Signaling Technology | 4211 | |
| 抗磷酸化Parkin Ser65抗体 | Affinity | AF3500 | |
| 抗VDAC1抗体 | Cell Signaling Technology | 4661 | |
| 抗LC3抗体 | Sigma | L8918 | |
| 抗p62抗体 | MBL | PM045 | |
| 抗caspase 8抗体 | Novus Biologicals | NB100-56116 | |
| 抗剪切caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| 抗精氨酸酶1抗体 | Cell Signaling Technology | 9819 | |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Antgene | ANT328 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Yeasen | 30101ES50 | |
| 抗GAPDH抗体 | Antgene | ANT324 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖 | Pierce | -- |
| NLRP3炎症小体重构 | 脂多糖 | -- | -- |
| 三磷酸腺苷 | -- | -- | |
| VX765 | -- | -- | |
| ASC寡聚化实验 | 双琥珀酰亚胺辛二酸酯 | Pierce | -- |
| 巨噬细胞极化 | 干扰素γ | R&D Systems | -- |
| 白细胞介素-4 | R&D Systems | -- | |
| 凋亡细胞生成 | 钙黄绿素AM | -- | -- |
| 星形孢菌素 | -- | -- | |
| 体内实验 | 异氟烷 | RWD | -- |
| 肝素 | Wanbang | -- | |
| 脂质测量 | Leadman血脂检测试剂盒 | Leadman | -- |
| 组织学染色 | Verhoeff染液 | Leagene | -- |
| 泡沫细胞形成 | 氧化低密度脂蛋白 | Invitrogen | -- |
| 油红O | -- | -- | |
| LDH释放检测 | 细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| ELISA | IL-1β酶联免疫试剂盒 | Neobioscience | -- |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | -- | -- | |
| 线粒体红色荧光探针 | -- | -- | |
| PI/Hoechst染色 | Hoechst 33342 | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| mtDNA释放 | Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞与组织DNA提取试剂盒 | -- | -- | |
| 亚细胞分级分离 | 细胞质和线粒体蛋白提取试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| 动物实验 | 高脂饮食 | Research Diets | D12079B |
| 蓖麻油 | -- | -- | |
| 原位胞葬分析 | TUNEL检测试剂盒 | Promega | -- |
| 免疫组化 | 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-130616 |
| 抗MCP1抗体 | R&D Systems | 479-JE-010 | |
| 抗活化caspase 1抗体 | Invitrogen | AAC504N | |
| 抗ICAM1抗体 | R&D Systems | AF796 | |
| 抗Mac3抗体 | BD Pharmingen | 550292 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC）、培养基（DMEM/RPMI1640）和FBS浓度（10%） 阅读提示：Materials and methods：Cell culture, plasmids and transfection |
| NLRP3炎症小体激活 | LPS浓度（100ng/mL）、ATP浓度（5mM）、刺激时间（LPS 8h，ATP 1h） 阅读提示：Materials and methods：Preparation of bone marrow-derived macrophages；结果部分Fig.1图注 |
| VX765处理 | 体外浓度（28μg/mL）和处理时间（2h）；体内剂量（75mg/kg）、频率（每周3次）、给药方式（腹腔注射）和溶剂（20%蓖麻油） 阅读提示：Materials and methods：Animal treatment；结果部分图注 |
| 动物模型 | 小鼠品系（Ldlr−/−，ApoE−/−，Nlrp3−/−;ApoE−/−）、年龄（6-8周）、饮食（高脂饮食D12079B）及处理时长（Ldlr−/−10周, ApoE−/−12周） 阅读提示：Materials and methods：Animal treatment and characterization of atherosclerotic plaques；结果部分Fig.5A,Fig.6A,Fig.7A |
| 斑块分析 | 主动脉取材范围（心脏出口至髂动脉分叉）、染色方法（油红O、Verhoeff）和定量方法（CellSens Standard软件） 阅读提示：Materials and methods：Animal treatment and characterization of atherosclerotic plaques |