网络模型构建与优化
构建wSDTNBI模型利用加权DTI和DSA网络预测DTI，并优化参数
从多个数据库收集药物和DTI数据，构建局部和全局加权DTI网络（边权重与Ki等负对数相关），生成九种指纹的DSA网络，并使用网格搜索和10折交叉验证优化参数。
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wSDTNBI：一种用于虚拟筛选的新型基于网络的推断方法
wSDTNBI: a novel network-based inference method for virtual screening.
实验完整度
高包含网络模型构建与评估、体外活性验证（GAL4、HTRF）、结合亲和力验证（ITC、DARTS、CETSA）、晶体结构解析及体内EAE模型验证，多层级且包含功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞（双荧光素酶报告基因和CETSA实验） RORγt-LBD重组蛋白（HTRF、ITC、DARTS等） C57BL/6小鼠EAE模型（多发性硬化症模型） 蛋白质晶体（RORγt-LBD-SRC2.2-熊果酸复合物）
重点核对
RORγt-LBD表达载体pET-15b及BL21(DE3)菌株 双荧光素酶报告基因实验中HEK293T细胞转染RORγt-GAL4与pGL4.31 HTRF实验中化合物浓度范围0.01 nM至100 μM ITC实验中蛋白质和化合物的缓冲液条件（20 mM Tris, 200 mM NaCl, 5 mM DTT, pH 7.0） EAE诱导使用MOG35-55和百日咳毒素，给药剂量50 mg/kg
摘要
近年来，基于网络的药物-靶点相互作用（DTI）预测方法的快速发展为一种新型虚拟筛选（VS）的出现提供了机会，即基于网络的VS。在此，我们报道了一种名为wSDTNBI的新型基于网络的推断方法。与以往使用无权DTI网络的网络方法相比，wSDTNBI使用加权DTI网络，其边权重与结合亲和力相关。采用基于加权DTI和药物-亚结构关联网络的双管齐下方法计算预测分数。为了展示wSDTNBI的实用价值，我们对维甲酸相关孤儿受体γt（RORγt）进行了基于网络的VS，并购买了72个化合物用于实验验证。其中7个购买的化合物经体外实验证实为新型RORγt反向激动剂，包括熊果酸和齐墩果酸，其IC50值分别为10 nM和0.28 μM。此外，通过X射线晶体结构证实了熊果酸与RORγt的直接接触，体内实验表明熊果酸和齐墩果酸对多发性硬化症具有治疗效果。这些结果表明wSDTNBI可能成为药物发现中基于网络的VS的强大工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何改进网络方法以使预测分数与结合亲和力相关，并应用于虚拟筛选发现高活性化合物？
- 核心机制
- wSDTNBI通过使用加权DTI网络和药物-亚结构关联网络，结合bSDTNBI评分和相似性评分，生成与结合亲和力相关的预测分数，从而识别高活性化合物。
- 主要证据
- 通过10倍交叉验证和外部验证显示wSDTNBI的r值高于0.55，优于传统方法；在RORγt虚拟筛选中，7/72化合物被验证为反向激动剂，其中熊果酸和齐墩果酸的IC50分别为0.10 μM和10 nM，并通过晶体结构、ITC、DARTS、CETSA和EAE模型验证其直接结合和疗效。
- 研究意义
- wSDTNBI可能成为网络虚拟筛选的有力工具，而且新发现的反向激动剂（如熊果酸和齐墩果酸）可能作为治疗自身免疫疾病（如多发性硬化）的先导化合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模型性能评估
评估模型预测DTI和结合亲和力相关性的性能
对56个模型进行10折交叉验证，计算R、eR、AUROC、r、MAE、RMSE；外部验证用核受体配体验证预测分数与pKi的相关性，并与分子对接比较。
RORγt虚拟筛选与初步验证
使用最优模型对RORγt进行虚拟筛选并验证化合物活性
使用Global-wSDTNBI-FCFP_4对730个天然产物和12751个药物预测靶点，购买72个预测配体，通过GAL4报告基因和HTRF实验验证活性，鉴定出7个反向激动剂。
结合机制验证
验证熊果酸和齐墩果酸与RORγt的直接结合及机制
使用荧光淬灭、ITC、DARTS和CETSA验证两种化合物与RORγt-LBD的直接结合，并通过X射线晶体学确定熊果酸在正交构位点的结合模式。
体内药效验证
评估熊果酸和齐墩果酸对EAE小鼠模型的治疗效果
在C57BL/6小鼠中用MOG35-55诱导慢性进行性EAE，从第12天开始口服给药10天，评估临床评分、体重、脊髓组织学、血脑屏障通透性、脾脏Th17细胞频率和组织IL-17水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 网络模型构建 | DrugBank数据库 | -- | 5.1.3 |
| IUPHAR/BPS药理学指南 | -- | -- | |
| KEGG DRUG数据库 | -- | -- | |
| 治疗靶点数据库 | -- | -- | |
| ChEMBL数据库 | -- | 25 | |
| BindingDB数据库 | -- | 2019m4 | |
| PDSP Ki数据库 | -- | -- | |
| Open Babel | -- | 2.4.1 | |
| PaDEL描述符 | -- | 2.21 | |
| Discovery Studio | -- | 3.5 | |
| 分子对接 | Glide | Schrödinger | 7.0 |
| LigPrep | Schrödinger | 2016 | |
| 蛋白质准备向导 | Schrödinger | 2016 | |
| 网络可视化 | Cytoscape | -- | 3.4.0 |
| 蛋白质纯化 | pET-15b载体 | Novagen | -- |
| HisTrap镍亲和柱 | GE Healthcare | -- | |
| 离心过滤器 | Merck Millipore | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | pFN11A (BIND) Flexi载体 | Promega | -- |
| pGL4.31载体 | Promega | -- | |
| pRL-SV40载体 | Promega | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | Dual-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| EnVision多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| HTRF | 铕标记抗His抗体 | Cisbio | -- |
| XL665标记链霉亲和素 | Cisbio | -- | |
| 低体积384孔白板 | PerkinElmer | -- | |
| 荧光淬灭 | Cary Eclipse荧光分光光度计 | Agilent Technologies | -- |
| ITC | ITC200等温滴定量热仪 | Microcal | -- |
| DARTS | 链霉蛋白酶E | Yuanye Bio-Technology | -- |
| SimplyBlue染色剂 | -- | -- | |
| CETSA | MG132 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ECL Western印迹底物试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| EAE诱导 | MOG35-55 | GL Biochem | -- |
| 完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 百日咳毒素 | -- | -- | |
| EAE治疗 | 羧甲基纤维素 | -- | -- |
| 流式细胞术 | APC抗小鼠CD4抗体 | eBioscience | -- |
| FITC标记抗小鼠IL-17A抗体 | eBioscience | -- | |
| BD LSRII流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 体内成像 | BSA-Cy5.5 | -- | -- |
| IVIS Spectrum CT成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| ELISA | IL-17A ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
| R语言 | -- | 3.3.3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质表达与纯化 | 表达载体pET-15b，宿主菌BL21(DE3)，诱导条件（0.1 mM IPTG，16°C过夜），纯化缓冲液（Buffer A：20 mM Tris, pH 7.0, 200 mM NaCl, 4% glycerol），Ni柱洗脱梯度 阅读提示：Methods 2.5.2 表达式和纯化RORγt-LBD |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 细胞系HEK293T，转染量（2 μg RORγt-GAL4, 2 μg pGL4.31, 100 ng pRL-SV40），转染试剂Lipofectamine 2000，处理时间（24 h转染后加药，再24 h检测） 阅读提示：Methods 2.5.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| HTRF实验 | RORγt-LBD浓度100 nM，SRC1-2肽浓度100 nM，Eu标记抗体0.5 nM，XL665标记链霉亲和素41.67 nM，化合物浓度梯度0.01 nM-100 μM，缓冲液pH 7.0 阅读提示：Methods 2.5.4 均相时间分辨荧光（HTRF）实验 |
| ITC实验 | 缓冲液（20 mM Tris, 200 mM NaCl, 5 mM DTT, pH 7.0），温度25°C，DMSO浓度<1%，19次注射（每次2 μL，间隔120秒） 阅读提示：Methods 2.5.6 等温滴定量热（ITC）实验 |
| EAE模型 | 小鼠品系C57BL/6雌性8-10周龄，MOG35-55剂量200 μg，CFA乳化，百日咳毒素剂量200 ng（第0和2天），给药剂量50 mg/kg，给药途径口服，给药时间第12天起持续10天 阅读提示：Methods 2.6.1 EAE诱导和治疗 |