鉴定辐射下差异表达circRNAs
筛选与LUAD放疗相关的circRNA。
对未照射和照射（0,2,4 Gy）的A549细胞进行RNA-seq，鉴定差异表达circRNAs，并通过RT-qPCR验证。
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circNEIL3通过抑制miR-1184上调PIF1介导细胞焦亡影响肺腺癌放疗
CircNEIL3 mediates pyroptosis to influence lung adenocarcinoma radiotherapy by upregulating PIF1 through miR-1184 inhibition.
实验完整度
高包含体外细胞实验（焦亡表型、功能验证）、分子机制实验（双荧光素酶、RIP）及体内小鼠移植瘤模型，多层级验证且机制明确。
主要模型
A549和H1299人肺腺癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
A549和H1299细胞系，辐射剂量0、2、4 Gy circNEIL3敲低和过表达慢病毒载体 PIF1 siRNA（si-h-PIF1_001） miR-1184 mimics和inhibitor 体内实验分组：si-NC、si-circNEIL3、si-NC+IR、si-circNEIL3+IR
摘要
环状RNA（circRNAs）属于丰富且稳定、特异的一类非编码RNA，因此在癌症治疗中具有巨大潜力。然而，关于circRNAs在肺腺癌（LUAD）放疗中的作用知之甚少。在此，我们建立了未照射和照射的A549细胞中1,875个失调circRNAs的表达谱，并鉴定出circNEIL3是在分别用0、2或4 Gy辐射处理的A549细胞中显著下调的circRNA。功能实验表明，circNEIL3敲低促进辐射诱导的细胞焦亡，而circNEIL3过表达则产生相反的效果。重要的是，circNEIL3过表达抑制焦亡的作用可被PIF1敲低所逆转。机制上，circNEIL3介导的焦亡通过直接结合miR-1184作为海绵，从而释放miR-1184对PIF1的抑制，最终诱导DNA损伤并触发AIM2炎症小体活化。在体内，circNEIL3敲低显著增强了放疗疗效，表现为肿瘤体积和重量减小。总之，介导焦亡诱导的circNEIL3/miR-1184/PIF1轴可能成为肺癌临床治疗的一种新的、有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circRNAs在肺腺癌放疗中的作用及机制尚不清楚，特别是circNEIL3是否通过调控焦亡影响放疗疗效。
- 核心机制
- circNEIL3作为miR-1184的海绵，解除miR-1184对PIF1的抑制，上调PIF1，导致DNA损伤和AIM2炎症小体活化，进而诱导细胞焦亡。
- 主要证据
- 体外实验显示circNEIL3敲低促进辐射诱导的焦亡，过表达则抑制；PIF1敲低逆转circNEIL3过表达的效果；双荧光素酶和RIP验证circNEIL3直接结合miR-1184；体内实验显示circNEIL3敲低增强放疗疗效。
- 研究意义
- circNEIL3/miR-1184/PIF1轴介导焦亡，可能作为增强肺癌放疗的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circNEIL3特征验证
确认circNEIL3为环状RNA及其稳定性。
通过Sanger测序、RNase R处理、放线菌素D实验和细胞分级实验验证circNEIL3的环状特征、稳定性和细胞质定位。
体外功能实验评估circNEIL3对焦亡的影响
确定circNEIL3对辐射诱导焦亡的影响。
在A549和H1299细胞中敲低或过表达circNEIL3，检测焦亡相关指标（LDH释放、IL-1β/IL-18分泌、Annexin V/7-AAD双阳性比例、caspase-1和GSDMD-N表达）。
验证PIF1为circNEIL3下游靶点
确定circNEIL3是否通过PIF1调控焦亡。
检测circNEIL3敲低或过表达后PIF1表达变化，并利用si-PIF1敲低验证对circNEIL3诱导的焦亡的影响。
机制解析：circNEIL3靶向miR-1184
阐明circNEIL3如何调控PIF1。
通过AGO2免疫沉淀、双荧光素酶报告基因实验验证circNEIL3与miR-1184结合，以及miR-1184对PIF1的靶向调控。
体外验证circNEIL3/miR-1184/PIF1轴介导焦亡
确认轴对焦亡的调控作用。
使用miR-1184 mimics或与circNEIL3共转染，检测焦亡相关指标的改变。
体内评估circNEIL3敲低对放疗疗效的影响
验证circNEIL3敲低在体内增强放疗效果。
建立A549皮下移植瘤模型，分为si-NC、si-circNEIL3、si-NC+IR、si-circNEIL3+IR四组，测量肿瘤体积和重量，并进行免疫组化检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 辐射处理 | X-RAD 160-225 | Precision X-Ray | -- |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Solarbio | -- |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| circRNA测序 | 生物分析仪2100 | Agilent | -- |
| HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞活力检测 | 6孔板 | Corning | -- |
| RNase R处理 | 核糖核酸酶R | Epicentre Technologies | -- |
| RNeasy MinElute清洗试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 细胞核质分离 | NE-PER提取试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 载体构建和转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| PIF1敲低 | siRNA试剂盒 | RiboBio | -- |
| LDH释放检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| ELISA | QuantiCyto IL-1β ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | -- |
| QuantiCyto IL-18 ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | -- | |
| 流式分析 | Annexin V-PE/7-AAD检测试剂盒 | KeyGEN | -- |
| FACSCalibur流式细胞仪 | Becton-Dickinson | -- | |
| Western blot | 抗Caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab219800 | |
| 抗GSDMD-N抗体 | Abcam | ab215203 | |
| 抗ASC抗体 | Abcam | ab180799 | |
| 抗AIM2抗体 | Abcam | ab93015 | |
| 抗γH2AX抗体 | CST | 9718 | |
| 抗PIF1抗体 | Proteintech | 19006-1-AP | |
| 抗BRCA1抗体 | Proteintech | 22362-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 化学发光辣根过氧化物酶底物 | Millipore | -- | |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL3启动子载体 | -- | -- |
| pmiR-RB-Report™载体 | RiboBio | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 免疫荧光 | 奥林巴斯BX51显微镜 | Olympus | -- |
| DP50相机 | Olympus | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Dossy Experimental Animals Co., Ltd | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7.0 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和辐射处理 | 细胞系A549和H1299；培养基RPMI-1640；辐射剂量0、2、4 Gy；辐射后48小时检测 阅读提示：Methods: Cell lines and cultures, Irradiation treatment |
| circNEIL3敲低和过表达 | 慢病毒载体（GPLVX-circRNA_Mini-GFP-Puro和PGMLV-SC5 RNAi）；转染试剂Lipofectamine 3000 阅读提示：Methods: Vector construction and cell transfection |
| 焦亡检测 | LDH检测试剂盒；IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒；Annexin V-PE/7-AAD检测试剂盒；流式细胞仪FACSCalibur 阅读提示：Methods: LDH, IL-1β, and IL-18 release assay, Flow cytometry |
| Western blot | 抗体列表（caspase-1, GSDMD, γH2AX, PIF1等） 阅读提示：Methods: Western blot |
| 双荧光素酶报告基因 | 载体pGL3-promoter和pmiR-RB-Report™；miR-1184 mimics；突变构建 阅读提示：Methods: Dual-luciferase reporter assay |
| 体内动物模型 | BALB/c裸鼠；A549细胞接种数量1×10^6；辐射剂量4 Gy/周；分组设置 阅读提示：Methods: Mouse xenograft model |