冷冻微针的制备与表征
验证冷冻微针能够封装活DC和aPD1，并具有足够的机械强度以穿透皮肤。
采用逐步低温微模塑法制备含有DC和aPD1的冷冻微针，并与3D打印手柄结合；观察微针形态，测量尺寸；在猪皮肤上进行插入实验，并进行组织学分析。
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冷冻微针共递送树突状细胞疫苗和抗PD-1抗体用于联合免疫治疗
Co-delivery of dendritic cell vaccine and anti-PD-1 antibody with cryomicroneedles for combinational immunotherapy.
实验完整度
高包含冷冻微针制备与表征、体外细胞活力检测、皮肤插入实验、体内免疫应答及治疗和预防性肿瘤模型等多个独立实验层级，并进行了功能验证和机制分析。
主要模型
B16-OVA黑色素瘤小鼠模型 小鼠骨髓来源树突状细胞 猪离体皮肤
重点核对
冷冻微针的制备条件：冷冻介质为含2% DMSO和100 mM蔗糖的PBS 每片冷冻微针中DC和aPD1的剂量：1×10^5细胞和6 μg DC活力检测：calcein AM/PI染色和流式细胞术 小鼠免疫方案：在第0、3、6、9天给予4片冷冻微针 治疗模型：皮下接种2×10^5 B16-OVA细胞，6天后给予冷冻微针
摘要
树突状细胞（DC）疫苗与抗程序性细胞死亡蛋白1抗体（aPD1）的联合免疫治疗被认为是很有前景的癌症治疗策略，因为它不仅能诱导肿瘤特异性T细胞免疫反应，还能通过肿瘤的免疫抑制微环境来防止T细胞功能衰竭。微针已成为一种用于高效经皮免疫治疗的创新平台。然而，由于传统的微针平台不适用于活细胞和抗体等脆弱的治疗药物，因此尚未研究通过微针共递送DC疫苗和aPD1。本研究采用我们新发明的冷冻微针（cryoMNs）来共递送DC疫苗和aPD1进行联合免疫治疗。冷冻微针是通过将预悬浮的DC和aPD1的冷冻介质进行逐步低温微模塑制备而成，并进一步与自制手柄集成，便于使用。冷冻微针中DC的活力保持在85%以上。冷冻微针具有足够的机械强度，可插入猪和小鼠皮肤中，并在融化后成功地将DC和aPD1释放到皮肤组织内。通过冷冻微针共递送卵清蛋白（OVA）脉冲的DC（OVA-DCs）和aPD1，与单独递送OVA-DCs或aPD1相比，诱导了更高的抗原特异性细胞免疫应答。最后，使用共封装OVA-DCs和aPD1的冷冻微针给药增加了肿瘤中效应T细胞的浸润，与加载OVA-DCs或aPD1的冷冻微针给药相比，在预防和治疗性黑色素瘤模型中均产生了更强的抗肿瘤治疗效果。这项研究证明了冷冻微针作为治疗性细胞和生物大分子共递送系统用于联合治疗的巨大潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用冷冻微针共递送DC疫苗和aPD1实现有效的联合免疫治疗？
- 核心机制
- 共递送OVA-DCs和aPD1可增强抗原特异性T细胞免疫应答，增加肿瘤内效应T细胞浸润并减少调节性T细胞，从而产生协同抗肿瘤效果。
- 主要证据
- 在预防和治疗性黑色素瘤模型中，CryoMNs@OVA-DC&aPD1组较单独递送组显著抑制肿瘤生长，增加CD8+和CD4+ T细胞浸润，降低Treg比例，并提高血清IFN-γ和IL-6水平。
- 研究意义
- 冷冻微针有望成为同时递送治疗性活细胞和生物大分子用于联合治疗（不仅限于癌症免疫治疗）的局部共递送平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DC活力评估
评估封装在冷冻微针中的DC在融化后的存活率，并确认aPD1的共存不影响DC活力。
将冷冻微针融化后释放DC，使用calcein AM和PI染色进行活/死细胞染色，并通过流式细胞术定量活细胞百分比。
皮肤插入及皮内共递送验证
验证冷冻微针能够成功穿透皮肤并将DC和aPD1递送到真皮层。
将负载Hoechst染色的DC和FITC-aPD1的冷冻微针插入猪皮肤和小鼠背部皮肤，通过荧光成像观察皮肤切片中的递送情况。
体内免疫应答评估
评估共递送OVA-DCs和aPD1是否能增强抗原特异性免疫应答。
小鼠分组后在第0、3、6、9天接受不同冷冻微针处理，取引流淋巴结和脾脏，通过流式检测DC成熟标志物（CD86、MHCII），通过alamarBlue检测脾细胞增殖，ELISA检测IFN-γ分泌，LDH法检测CTL活性。
治疗性抗肿瘤效果评估
评估共递送OVA-DCs和aPD1对已建立肿瘤的抑制效果及免疫机制。
皮下接种B16-OVA细胞后6天，给予不同冷冻微针处理（第6、9、12、15天），测量肿瘤生长曲线、肿瘤重量，并分析肿瘤浸润淋巴细胞、血清细胞因子水平。
预防性抗肿瘤效果评估
评估共递送OVA-DCs和aPD1作为预防性疫苗的效果。
在第0、3、6、9天给予小鼠冷冻微针处理，第12天皮下接种B16-OVA细胞，监测肿瘤生长和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | alamarBlue™细胞活力试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| LIVE/DEAD™活力/细胞毒性试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| DC生成 | 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | -- |
| 重组小鼠IL-4 | Peprotech | -- | |
| ELISA | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | StemCell Pte. Ltd. | -- |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Neo-Bioscience | -- | |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Neo-Bioscience | -- | |
| 组织学分析 | H&E染色试剂盒 | Abcam | ab245880 |
| 肝功能检测 | ALT活性检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| AST活性检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 流式分析 | 抗小鼠MHC II类抗体（APC，克隆AF6-120.1） | ThermoFisher Scientific | -- |
| CD86抗体（APC，克隆GL1） | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 抗小鼠CD8a抗体（FITC，克隆53-6.7） | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠CD4抗体（APC，克隆RM4-5） | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠CD279（aPD-1）抗体（Ultra-LEAF™纯化，克隆RMP1-14） | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠CD279抗体（FITC，克隆29F.1A12） | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠FOXP3抗体（PE，克隆MF-14） | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠CD3抗体（PE，克隆17A2） | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠CD11c抗体（FITC，克隆N418） | BioLegend | -- | |
| 细胞染色 | NucBlue™活细胞ReadyProbes™试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| CTL检测 | CyQUANT™ LDH细胞毒性检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 细胞处理 | ACK裂解缓冲液 | ThermoFisher Scientific | -- |
| MEM非必需氨基酸溶液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 冷冻微针制备 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Sylgard® 184硅酮弹性体试剂盒 | Dow Corning | -- | |
| OVA脉冲 | 卵清蛋白（来自鸡蛋清） | Sigma-Aldrich | -- |
| 设备 | 体视显微镜（T2-3M80） | Aosvi | -- |
| 倒置显微镜（CKX53） | Olympus | -- | |
| 低温恒温器（NX70） | Thermo Scientific | -- | |
| 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 软件 | FlowJo软件 | TreeStar | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 冷冻微针制备 | 冷冻介质配方：2% DMSO和100 mM蔗糖的PBS；DC和aPD1的装载量：1×10^5细胞和6 μg；离心参数（3000 rpm 3 min, 500 rpm 1 min）；冻存步骤（4°C 20 min, -20°C 4 h, -80°C overnight） 阅读提示：见Experimental Section 4.4 Fabrication of DCs and aPD-1 co-encapsulated cryoMN patch |
| DC生成与OVA脉冲 | 骨髓来源DC生成条件：GM-CSF 20 ng/ml, IL-4 10 ng/ml；OVA脉冲浓度：50 μg/ml，孵育24 h 阅读提示：见Experimental Section 4.3 Generation of antigen (OVA) pulsed dendritic cells |
| 体内免疫应答评估 | 小鼠免疫方案：4片冷冻微针在第0、3、6、9天给予；每组n=5；检测时间：最后一次免疫后3天；OVA再刺激浓度：50 μg/ml；CTL共培养比例：100:1 阅读提示：见Experimental Section 4.7 In vivo immune responses after administration of cryoMNs |
| 治疗性肿瘤模型 | B16-OVA接种量：2×10^5细胞皮下注射；治疗时间：接种后6天开始，第6、9、12、15天给予；每组n=5；肿瘤测量公式：宽度^2×长度×0.5；血清采集时间：第18天；肿瘤取材时间：第22天 阅读提示：见Experimental Section 4.8 In vivo antitumor effect |
| 预防性肿瘤模型 | 免疫时间：第0、3、6、9天；肿瘤接种：第12天皮下2×10^5 B16-OVA细胞；每组n=5 阅读提示：见Experimental Section 4.8 In vivo antitumor effect |