Wdr45敲除小鼠的构建与验证
构建Wdr45敲除小鼠模型以模拟BPAN的病理过程。
使用CRISPR-Cas9技术靶向Wdr45基因外显子6，产生移码突变。通过PCR、DNA测序、real-time PCR和PRM质谱验证基因敲除效果。
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WDR45通过调节内质网稳态和神经元死亡参与神经退行性变
WDR45 contributes to neurodegeneration through regulation of ER homeostasis and neuronal death.
实验完整度
高包括CRISPR-Cas9敲除小鼠模型、行为学测试、电生理记录、定量蛋白质组学、细胞实验（shRNA敲低、过表达、抑制剂处理）及体内外功能验证（ER应激、凋亡）和药理学挽救实验。
主要模型
wdr45基因敲除小鼠 WDR45敲低HeLa细胞 原代皮层神经元
重点核对
Wdr45基因敲除小鼠模型（CRISPR-Cas9删除外显子6中CC二核苷酸） 敲低细胞系（sh-WDR45） 内质网应激诱导剂衣霉素（Tm，2 μg/ml）处理 自噬抑制剂BafA1（50 nM, 8 h）和蛋白酶体抑制剂MG132（20 μM, 12 h）处理 mTOR抑制剂雷帕霉素（100 nM, 24 h）和ER应激抑制剂TUDCA（100 μM, 24 h）处理
摘要
自噬基因WDR45的突变导致β-螺旋桨蛋白相关的神经退行性变（BPAN）；然而该疾病过程的分子和细胞机制在很大程度上是未知的。在这里，我们生成了组成性wdr45基因敲除（KO）小鼠，其表现出认知障碍、异常突触传递和多个脑区的病变。免疫组织化学分析显示，老年小鼠前额叶皮层和基底神经节神经元丢失，且前额叶皮层凋亡增加，重现了神经退行性变的标志。定量蛋白质组学分析显示KO小鼠内质网（ER）蛋白积累。在细胞水平上，WDR45缺乏导致ER蛋白积累，引起ER应激增加和ER质量控制受损。未折叠蛋白反应（UPR）通过ERN1/IRE1或EIF2AK3/PERK通路升高，最终导致神经元凋亡。抑制ER应激或通过MTOR抑制激活自噬减轻了细胞死亡。因此，WDR45的缺失损害了神经元的巨自噬机制，导致细胞器自噬受损，这为BPAN的病因提供了机制性理解，并为治疗这种遗传性疾病提供了潜在的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- WDR45缺失如何导致BPAN中的神经退行性变，自噬功能障碍是否是主要的细胞基础？
- 核心机制
- WDR45缺失导致巨自噬缺陷，引起内质网（ER）蛋白积累，导致ER应激增加和ER质量控制受损，通过ERN1/IRE1和EIF2AK3/PERK通路激活UPR，最终导致神经元凋亡。
- 主要证据
- wdr45敲除小鼠表现出认知障碍、神经元丢失和凋亡；定量蛋白质组学显示ER蛋白积累；细胞实验表明WDR45缺失导致ER应激和凋亡增加；雷帕霉素或TUDCA可减轻细胞死亡。
- 研究意义
- 该研究揭示了BPAN的发病机制，表明ER应激和UPR可能是潜在的干预靶点，为治疗BPAN提供了潜在的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
行为学表型分析
评估Wdr45敲除小鼠的认知、运动和社交行为是否异常。
对6月龄小鼠进行Morris水迷宫、八臂迷宫、旋转杆、条件恐惧、匹罗卡品诱发癫痫、大理石掩埋和社交接近测试。
神经元丢失与突触功能分析
检查老年小鼠脑区神经元丢失和突触传递异常。
对16月龄小鼠脑切片进行TH和RBFOX3免疫染色、TUNEL染色；对6月龄小鼠海马CA1神经元进行全细胞膜片钳记录mEPSCs。
定量蛋白质组学分析
鉴定Wdr45敲除小鼠脑区中差异表达的蛋白质，特别是内质网蛋白。
分离PFC、HIP和MIB，使用TMT标记和LC-MS/MS定量蛋白质组学分析，并结合生信分析（DAVID、WGCNA）揭示ER蛋白积累。
候选蛋白降解途径的验证
验证WDR45是否通过自噬或蛋白酶体途径降解ER蛋白。
在HeLa细胞中共表达WDR45和候选ER蛋白（SEC22B、BCAP31、SEC61B、CDIPT），分别使用BafA1或MG132处理，检测蛋白水平变化；并利用shRNA敲低WDR45观察蛋白积累。
内质网应激与UPR通路分析
探究WDR45缺失是否导致内质网应激和UPR激活。
使用Western blot检测HeLa细胞和原代皮层神经元中HSPA5、p-ERN1、XBP1剪接、p-EIF2A等；并观察ER形态和ER自噬（CALR与LAMP1共定位）。
凋亡检测与药理学挽救
评估WDR45缺乏导致的细胞死亡是否可通过干预ER应激或自噬来挽救。
使用FACS检测Annexin V/7-AAD阳性细胞；Western blot检测cleaved-CASP3；用雷帕霉素或TUDCA处理后观察凋亡和自噬指标变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除小鼠构建 | Cas9 mRNA | -- | -- |
| sgRNA | -- | -- | |
| 胚胎培养 | KSOM培养基 | Millipore | MR-106-D |
| 药物处理 | 匹罗卡品 | Selleck | S4231 |
| 雷帕霉素 | Sigma-Aldrich | V900930 | |
| 牛磺熊去氧胆酸 | Shang Hai Yuan Ye | B20921 | |
| 衣霉素 | Cell Signaling Technology | 12819 | |
| 巴弗洛霉素A1 | Sigma-Aldrich | B1793 | |
| MG132 | Selleck | S2619 | |
| Western blot | 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 12698 |
| 抗ACTB抗体 | YEASEN | 30101-ES10 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | 1804 | |
| 抗CALR抗体 | Abcam | ab92516 | |
| 抗SQSTM1抗体 | Sigma-Aldrich | B0062 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abways | AB0037 | |
| 抗cleaved CASP3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 免疫荧光 | 抗TOMM20抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc11415 |
| Western blot | 抗LC3抗体 | Sigma-Aldrich | 2775S |
| 抗HSPA5抗体 | Abways | CY5166 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | 11965 |
| 胎牛血清 | GEMINI | 900-108 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 690049 | |
| 原代神经元培养 | 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | 1495005 |
| MEM培养基 | Gibco | 41090093 | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P1524 | |
| Neurobasal培养基 | Invitrogen | 17504044 | |
| 谷氨酰胺 | Invitrogen | 35050061 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| NP40 | Sangon Biotech | A510110 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694 |
| 牛血清白蛋白 | MP Biomedicals | SKU-0215240110 | |
| Alexa Fluor 405二抗 | Life Technology | A-31553 | |
| Alexa Fluor 546二抗 | Life Technology | A-11003 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | Life Technology | A-11001 | |
| 免疫组织化学 | 蔗糖 | Sigma-Aldrich | V900116 |
| DAB显色液 | NEOBIOSCIENCE | ENS004 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Gene solution | B140101 |
| RT-qPCR | Prime ScriptII第一链cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | 11752050 |
| SYBR Premix试剂 | Promega | A6001 | |
| 流式细胞术 | ANXA5-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1062 |
| TUNEL | TUNEL试剂盒 | Yeasen | 403006 |
| 蛋白质组学 | 胰蛋白酶 | Promega | V5113 |
| TMT 10-plex标记试剂 | Thermo Scientific | 90110 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | 43217 | |
| C18色谱柱 | Waters | -- | |
| EASY-nLC1000液相色谱 | Thermo Scientific | -- | |
| Q-Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 转染 | pLKO.1puro载体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠构建 | 靶向Wdr45外显子6的sgRNA序列和PAM序列；Cas9 mRNA和sgRNA注射浓度；胚胎移植小鼠品系。 阅读提示：Materials and methods: Generation of wdr45 knockout mouse |
| 行为学测试 | 小鼠年龄（6个月）；各测试的样本量和性别；Morris水迷宫训练天数、试验次数和平台寻找时间；旋转杆转速程序；条件恐惧电击强度；匹罗卡品剂量；大理石掩埋和社交测试的时长。 阅读提示：Materials and methods: Behavior; Figure 1图注 |
| 神经元病理分析 | 小鼠年龄（16个月）；免疫荧光和TUNEL染色的抗体和定量方法；每脑切片数；阳性细胞计数标准。 阅读提示：Results section 'Wdr45 knockout mouse showed neuronal loss in the brain'; Figure 2图注 |
| 电生理记录 | 小鼠年龄（6个月）；脑片厚度和孵育条件；记录电极内液成分；mEPSC记录时的电压和药物（TTX、picrotoxin）浓度；刺激参数。 阅读提示：Materials and methods: Slice electrophysiology |
| 蛋白质组学 | 小鼠年龄（6-8个月）；性别（雄性）；样本量（5对）；TMT标记试剂；质谱仪器和参数；差异蛋白筛选标准（P值校正和差异倍数）。 阅读提示：Materials and methods: Quantitative proteomics; Figure 3图注 |
| 细胞实验 | HeLa和HEK293T细胞培养条件；转染试剂和DNA量；shRNA序列和敲低效率；BafA1、MG132、Tm、rapamycin、TUDCA的处理浓度和时间；抗体使用及稀释度。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transient transfection, Western blot, Immunofluorescence |
| 凋亡检测 | 凋亡诱导条件（Tm浓度和时间）；Annexin V/7-AAD染色步骤；流式细胞仪型号和数据分析软件。 阅读提示：Materials and methods: Analysis of apoptosis by FACS; Figure 8图注 |