鉴定TNFR2+ Treg细胞的趋化因子受体表达谱
明确TNFR2+ Treg细胞在MPE中富集相关的趋化因子受体。
对从MPE分离的TNFR2+和TNFR2- CD4+ T细胞进行RNA-seq，通过KEGG分析、流式细胞术验证差异表达的趋化因子受体（CXCR6、CCR4、CCR6），并进行Transwell趋化实验验证对MPE的趋化性。
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癌症相关成纤维细胞中的H3K18乳酸化通过招募TNFR2+ Treg细胞驱动恶性胸腔积液的进展
H3K18 lactylation in cancer-associated fibroblasts drives malignant pleural effusion progression via TNFR2+ Treg recruitment.
实验完整度
高包含体外细胞实验、Transwell趋化实验、小鼠MPE模型、临床样本分析及CUT&Tag、ChIP-qPCR等机制验证。
主要模型
MPE患者样本 小鼠MPE模型（LLC和MC-38） CAFs（来自MPE） NIH/3T3成纤维细胞
重点核对
MPE患者样本中TNFR2+ Treg细胞和CAFs的分离与培养方法 小鼠MPE模型中LLC-LUC或MC-38细胞及NIH/3T3共注射的剂量和途径 CAFs处理中DCA、oxamate、rotenone、β-alanine的浓度和时间 体内CXCL16中和抗体的给药剂量和途径
摘要
表达肿瘤坏死因子受体2的调节性T（TNFR2+ Treg）细胞是Treg细胞中抑制性最强的亚群，在恶性胸腔积液（MPE）中富集，并促进疾病进展。然而，其积累的潜在机制仍不清楚。在此，我们证明C-X-C基序趋化因子配体16（CXCL16）/C-X-C趋化因子受体6型（CXCR6）轴在将TNFR2+ Treg细胞募集到MPE中起关键作用，其中癌症相关成纤维细胞是CXCL16的主要来源。机制上，在胸腔内普遍存在的低氧条件下，MPE中的癌症相关成纤维细胞进行糖酵解，进而导致内源性乳酸产生增加。这种升高的乳酸诱导CXCL16基因及其转录因子叉头盒O3（FOXO3）启动子区域上的组蛋白H3赖氨酸18乳酸化（H3K18la），这可能有助于CXCL16的转录。高表达CXCR6（CXCL16的唯一受体）的TNFR2+ Treg细胞随后被募集到MPE中。TNFR2+ Treg细胞的浸润可能增强MPE的免疫抑制微环境，促进疾病进展。总之，这些发现揭示了一种控制MPE免疫抑制的新机制，为破坏该过程的潜在治疗策略提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TNFR2+ Treg细胞在MPE中富集的潜在机制是什么？
- 核心机制
- 低氧条件下，MPE中的CAFs进行糖酵解产生乳酸，乳酸诱导H3K18la修饰于CXCL16和FOXO3启动子，上调CXCL16表达，通过CXCL16-CXCR6轴将TNFR2+ Treg细胞募集到MPE，增强免疫抑制并促进疾病进展。
- 主要证据
- 通过RNA-seq和流式细胞术发现TNFR2+ Treg高表达CXCR6；ELISA显示MPE中CXCL16升高；Transwell实验证实CXCL16阻断减少迁移；小鼠MPE模型显示CXCL16阻断或LDHA敲除减少MPE进展；CUT&Tag和ChIP-qPCR证实H3K18la富集于CXCL16和FOXO3启动子。
- 研究意义
- 揭示MPE免疫抑制的新机制，为靶向乳酸产生或CXCL16的治疗策略提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CXCL16-CXCR6轴在TNFR2+ Treg募集中的作用
验证CXCL16是否介导TNFR2+ Treg细胞向MPE的迁移。
ELISA检测MPE和PB中CXCL16、CCL17、CCL22、CCL20浓度；Transwell趋化实验使用抗CXCL16、抗CCL17、抗CCL22、抗CCL20抗体或重组人CXCL16处理，流式检测迁移的TNFR2+ Treg细胞比例。
确认CAFs为MPE中CXCL16的主要来源
确定MPE中产生CXCL16的主要细胞类型。
流式细胞术分析MPE中不同细胞群（CAFs、中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞）的CXCL16表达；分离培养CAFs，收集条件培养基用于趋化实验，并用抗CXCL16抗体阻断。
评估CAF来源的CXCL16在体内的促肿瘤作用
验证CAF来源的CXCL16对MPE进展和免疫微环境的影响。
构建小鼠MPE模型（LLC-LUC或MC-38细胞与NIH/3T3共注射），注射抗CXCL16抗体或重组小鼠CXCL16，检测MPE体积、生存期、生物发光成像，流式分析TNFR2+ Treg和CD8+ T细胞比例及功能。
探讨低氧和乳酸对CAFs中CXCL16表达的影响
研究低氧条件下CAFs的糖酵解和乳酸产生是否与CXCL16表达相关。
将CAFs在低氧（1% O2）条件下培养，检测乳酸产生和CXCL16表达随时间变化；使用代谢调节剂（DCA、oxamate、rotenone）处理，检测乳酸和CXCL16水平。
验证内源性乳酸通过H3K18la上调CXCL16
证明乳酸通过组蛋白乳酸化促进CXCL16表达。
Western blot检测外源乳酸、葡萄糖、代谢抑制剂处理后CAFs中H3K18la和CXCL16水平；敲低LDHA或用β-alanine处理，检测H3K18la和CXCL16变化。
阐明H3K18la在CXCL16和FOXO3启动子上的富集及FOXO3对CXCL16的调控
揭示H3K18la修饰的靶基因及转录因子FOXO3的作用。
CUT&Tag和ChIP-qPCR检测CAFs中H3K18la在CXCL16和FOXO3启动子的富集；预测FOXO3结合位点，ChIP-qPCR验证FOXO3结合；敲低或过表达FOXO3检测CXCL16表达；双荧光素酶报告基因验证FOXO3对CXCL16转录的激活。
验证体内抑制乳酸产生或乳酸化对MPE进展的影响
评估靶向乳酸代谢或乳酸化对MPE的治疗潜力。
生成LDHA敲除的NIH/3T3细胞，与LLC-LUC共注射建立MPE模型，检测MPE体积、生存期、免疫指标；给予oxamate或β-alanine治疗，观察肿瘤负荷和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离 | Ficoll-Hypaque梯度离心 | StemCell Technologies | #18061 |
| 抗成纤维细胞磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | #130-050-601 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 乳酸 | MCE | HY-B0389 |
| 葡萄糖 | MCE | HY-B0389 | |
| 草氨酸盐 | MCE | HY-W013032A | |
| 鱼藤酮 | MCE | HY-B1756 | |
| β-丙氨酸 | MCE | HY-N0230 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026CN |
| 细胞分选 | CD4+ T细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-533 |
| 细胞处理 | TNFR2激动剂 | Hycult Biotech | HM2007BT |
| 同型对照 | Hycult Biotech | HI4001 | |
| 细胞培养 | MEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 固定/破膜浓缩液 | eBioscience | 00-5123-43 |
| 固定/破膜稀释液 | eBioscience | 00-5123-43 | |
| 破膜缓冲液 | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BD LSRFORTESSA X-20流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| 趋化实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 抗CCL17抗体 | R&D Systems | MAB364-SP | |
| 抗CCL20抗体 | R&D Systems | MAB360-SP | |
| 抗CCL22抗体 | R&D Systems | MAB336-SP | |
| 抗CXCL16抗体 | R&D Systems | MAB976 | |
| 重组人CXCL16 | R&D Systems | 976-CX-025/CF | |
| 动物实验 | D-荧光素 | MKBio | MX4603-1G |
| 生物发光成像 | Bruker In Vivo FX PRO成像仪 | Bruker | -- |
| Bruker MI SE software | Bruker MI SE软件 | Bruker | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞因子检测 | 人趋化因子抗体芯片试剂盒 | R&D Systems | ARY017 |
| ELISA | 人CCL17 ELISA试剂盒 | Neobioscience | NOV-NR-E10095-1x96T |
| 人CCL20 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DM3A00 | |
| 人CCL22 ELISA试剂盒 | Neobioscience | NOV-NR-E10101-1x96T | |
| 人CXCL16 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC168 | |
| 小鼠CXCL16 ELISA试剂盒 | RayBiotech | ELM-CXCL16 | |
| 乳酸检测 | 乳酸比色/荧光检测试剂盒 | Abcam | ab65330 |
| 多功能酶标仪 | PerkinElmer EnSpire | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0038 |
| Synergy 4酶标仪 | BioTek | -- | |
| 凋亡检测 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | 556547 |
| 质粒构建 | pCMV-FOXO3过表达质粒 | MiaoLingPlasmid | P38078 |
| FOXO3 shRNA质粒 | MiaoLingPlasmid | P21814 | |
| LDHA shRNA质粒1 | MiaoLingPlasmid | P27303 | |
| LDHA shRNA质粒2 | MiaoLingPlasmid | P27302 | |
| LDHA shRNA质粒3 | MiaoLingPlasmid | P27304 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| CRISPR | pX459载体 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| ChIP | Simple ChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| 抗L-乳酸化组蛋白H3 (Lys18)兔单抗 | PTM BIO | PTM-1427RM | |
| 抗FOXO3抗体 | Proteintech | 10849-1-AP | |
| CUT&Tag | CUT&Tag试剂盒 | Vazyme | TD903 |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 双荧光素酶 | pGL3-Basic载体 | Promega | -- |
| pRL-TK载体 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Beyotime Biotechnology | P1005 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗泛乳酸化抗体 | PTM BIO | PTM-1401 | |
| 抗H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-1406RM | |
| 抗H3K9la抗体 | PTM BIO | PTM-1419RM | |
| 抗H3K27la抗体 | PTM BIO | PTM-1428 | |
| 抗H4K12la抗体 | PTM BIO | PTM-1411RM | |
| 抗H4K8la抗体 | PTM BIO | PTM-1415RM | |
| 抗CXCL16抗体 | Proteintech | 60123-1-Ig | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Proteintech | 17168-1-AP | |
| 化学发光底物液 | Vazyme | E423-01 | |
| UVP化学发光成像系统 | UVP | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集 | MPE和PB的采集时间（24小时内）、离心条件（1500rpm 10min）、PEMCs分离方法（Ficoll梯度） 阅读提示：Materials and methods: Sample collection and processing |
| CAF分离与培养 | 贴壁时间（12h）、培养时间（7-10天）、鉴定标准（FAP和CD29 >90%，CD31和EPCAM阴性）、传代数（<10） 阅读提示：Materials and methods: Cell isolation and culture |
| 药物处理 | DCA、oxamate、β-alanine浓度（0-20 mM）、rotenone浓度（0-50 nM）、处理时间（48h）、培养基条件（低糖DMEM for glucose/rotenone） 阅读提示：Materials and methods: Cell isolation and culture |
| 流式细胞术 | 表面抗体孵育（20min RT）、破膜（30min）、胞内抗体孵育（30min）、分析方法（FlowJo v10.8.1） 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry |
| Transwell趋化实验 | PEMCs数量（1×10^6）、孔径（8.0μm）、下室条件（MPE上清或CAF上清）、抗体浓度（50 ng/ml）、重组CXCL16浓度（100 ng/ml）、孵育时间（4h） 阅读提示：Materials and methods: Transwell chemotaxis assay |
| 小鼠MPE模型 | 小鼠品系（C57BL/6，6周龄雌性）、细胞数量（LLC或MC-38：2×10^5；NIH/3T3：1×10^5）、注射途径（胸腔） 阅读提示：Materials and methods: Murine MPE models |
| 体内抗体处理 | 抗CXCL16抗体剂量（50 μg/kg）、给药途径（胸腔内注射）、时间点（第6、9、12天） 阅读提示：Materials and methods: Murine MPE models |
| 重组蛋白处理 | 重组小鼠CXCL16剂量（50 μg/kg）、给药途径（胸腔内）、时间点（第6、8、10天） 阅读提示：Materials and methods: Murine MPE models |
| LDHA敲除 | CRISPR-Cas9方法、sgRNA序列（Supplementary Table 3）、筛选浓度（未明确说明） 阅读提示：Materials and methods: Vector construction and cell transfection |