HIRI模型建立与Btg2表达分析
建立小鼠HIRI模型并检测Btg2在HIRI后的表达变化。
对雄性C57BL/6J小鼠进行70%缺血（1小时）再灌注（6小时）手术，收集肝脏和血清样本。通过RNA-Seq、Western blot、RT-qPCR、IHC和免疫荧光检测Btg2表达。
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Btg2抑制Fmo1 UFM化从而加重肝缺血再灌注损伤中的铁死亡和细胞凋亡
Btg2 inhibits Fmo1 UFMylation thus exacerbating ferroptosis and apoptosis in hepatic ischemia-reperfusion injury.
实验完整度
高包含体内小鼠HIRI模型（Btg2敲除/转基因、AAV介导的Fmo1过表达/敲低）、体外原代肝细胞H/R模型、代谢组学、IP-MS、分子对接与虚拟筛选，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠70% HIRI模型 Btg2全身敲除（Btg2-/-）小鼠 肝细胞特异性Btg2转基因（Btg2HTG）小鼠 原代小鼠肝细胞
重点核对
Btg2表达在HIRI后显著升高，并在1h缺血/6h再灌注时达到峰值 Btg2敲除减轻HIRI诱导的炎症、线粒体损伤和凋亡，而Btg2过表达加重这些损伤 Btg2与Fmo1相互作用并通过Box-C结构域抑制Fmo1的UFM化，促进其K48泛素化降解 Fmo1过表达恢复牛磺酸合成，抑制铁死亡和凋亡，减轻HIRI DTA（25mg/kg，口服灌胃，每日一次，持续7天）通过抑制Btg2减轻HIRI
摘要
肝缺血再灌注损伤（HIRI）是肝脏手术中常见的病理状况，然而HIRI的调控机制仍未完全阐明。在此，我们研究了B细胞易位基因2（Btg2）在HIRI中的作用。HIRI后Btg2表达上调。利用肝细胞特异性Btg2转基因和系统性Btg2敲除小鼠的70% HIRI模型，我们发现Btg2加重肝脏炎症和细胞凋亡。在原代肝细胞中，Btg2敲低可减轻缺氧/复氧（H/R）诱导的炎症和线粒体应激。代谢组学表明，Btg2-/-小鼠肝脏中牛磺酸代谢显著受影响。机制上，Btg2抑制含黄素单加氧酶1（Fmo1）（一种关键的牛磺酸合成酶）的UFM化，促进其K48连接的泛素化和降解。病毒介导的Fmo1过表达在体内和体外均显著抑制铁死亡、细胞凋亡和HIRI。天然化合物的虚拟筛选表明，Daturataturin A（DTA）抑制Btg2，从而减轻铁死亡和HIRI。这些结果表明，Btg2可能构成HIRI的一个有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Btg2在肝缺血再灌注损伤中扮演何种角色，以及其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- Btg2通过与Fmo1相互作用并抑制其UFM化（由E3连接酶Ufl1介导），促进Fmo1的K48连接泛素化降解，从而减少牛磺酸合成，加剧铁死亡和细胞凋亡。
- 主要证据
- 体内小鼠HIRI模型（Btg2敲除/过表达）、体外原代肝细胞H/R模型、代谢组学、免疫共沉淀和质谱分析显示，Btg2上调与HIRI加重相关，而Fmo1过表达或Btg2抑制可减轻铁死亡、凋亡和组织损伤。
- 研究意义
- 该研究揭示Btg2作为HIRI的关键介质，靶向Btg2可能为HIRI治疗提供新策略，DTA作为Btg2抑制剂具有治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Btg2功能验证
验证Btg2对HIRI炎症、凋亡和线粒体损伤的影响。
使用Btg2全身敲除（Btg2-/-）和肝细胞特异性转基因（Btg2HTG）小鼠，在HIRI后评估血清ALT/AST/LDH水平、H&E染色、TEM、TUNEL、免疫荧光（CD11b/Ly6G）、ELISA、Western blot和RT-qPCR等。
Btg2与Fmo1相互作用及对牛磺酸合成的影响
鉴定Btg2的相互作用蛋白，并研究其对牛磺酸合成的调控。
通过代谢组学分析Btg2-/-和Btg2+/+小鼠肝脏代谢差异，发现牛磺酸代谢显著受影响。通过IP-MS鉴定Fmo1为Btg2的相互作用蛋白，并用co-IP和免疫荧光验证。通过Btg2截短体定位结合域。检测Btg2过表达/敲低对Fmo1蛋白和mRNA水平的影响，以及肝脏牛磺酸浓度。
Fmo1对铁死亡和HIRI的影响
验证Fmo1过表达或敲低对HIRI中铁死亡、凋亡和组织损伤的作用。
在Btg2HTG原代肝细胞中过表达Fmo1（AdFmo1），在Btg2-/-原代肝细胞中敲低Fmo1（AdshFmo1），进行H/R处理后检测炎症因子、牛磺酸水平、Fe2+、LPO、MDA、GSH、细胞活力和铁死亡相关蛋白表达。体内使用AAV8-Fmo1和AAV8-shFmo1进行过表达和敲低，评估肝损伤、凋亡、铁死亡和组织学变化。
Btg2调控Fmo1的翻译后修饰机制
探究Btg2促进Fmo1降解的具体分子机制，特别是UFM化和泛素化的关系。
通过CHX实验检测Fmo1蛋白半衰期，用MG132抑制蛋白酶体。在AML12细胞中敲低si-Btg2或过表达Btg2-Flag，检测Fmo1泛素化水平。通过IP-MS筛选E3连接酶，确定Ufl1。验证Ufl1对Fmo1表达的影响，以及Btg2对Ufl1-Fmo1相互作用的影响。在HEK293T细胞中模拟UFM化系统，检测Fmo1的UFM化和K48泛素化。
DTA靶向Btg2的筛选与验证
筛选并验证天然化合物DTA对Btg2的抑制作用及其对HIRI的保护作用。
通过虚拟筛选（AutoDock Vina）和分子动力学模拟，从3191种天然化合物中筛选出DTA和DTI。在体内外实验中，评估DTA（体内25 mg/kg口服灌胃；体外25 μM处理）对HIRI和H/R诱导的损伤的保护作用，检测肝功能、组织学、凋亡、铁死亡、牛磺酸水平等指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| 1640培养基 | Gibco | -- | |
| DMEM/F12培养基 | 未明确说明 | -- | |
| 细胞分离 | IV型胶原酶 | Solarbio Lifesciences | -- |
| Percoll分离液 | Biosharp | -- | |
| 细胞培养 | D-Hanks平衡盐溶液 | -- | -- |
| HIRI模型 | 无损伤微血管夹 | -- | -- |
| 基因操作 | AdBtg2腺病毒 | Genepharma | -- |
| AdshBtg2腺病毒 | Genepharma | -- | |
| AAV8-Fmo1 | Genepharma | -- | |
| AAV8-shFmo1 | Genepharma | -- | |
| RNA提取与RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | -- |
| 肝功能指标检测 | ALT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| AST检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| LDH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 氧化应激指标检测 | MDA检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| GSH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 组织学染色 | H&E染色试剂盒 | Solarbio Lifesciences | -- |
| 凋亡检测 | 原位凋亡检测试剂盒（TUNEL） | Beyotime | -- |
| 免疫染色 | 牛血清白蛋白 | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| 牛磺酸检测 | 牛磺酸检测试剂盒 | Cell Biolabs | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 脂质过氧化物检测 | Liperfluo探针 | Dojindo | -- |
| 铁离子检测 | FerroOrange探针 | Dojindo | -- |
| TEM | 超薄切片机 | Leica | -- |
| 透射电子显微镜 | Thermo Fisher | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag抗体 | Merck | -- |
| IgG抗体 | Abmart | -- | |
| Protein A/G磁珠 | MedChemExpress | -- | |
| 质谱分析 | 快速银染试剂盒 | Beyotime | -- |
| nanoElute系统 | Bruker | -- | |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker | -- | |
| C18色谱柱 | Thermo Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 代谢组学 | Vanquish超高效液相色谱系统 | -- | -- |
| Q Exactive Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HILIC色谱柱 | -- | -- | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- | |
| 药物处理 | DTA（曼陀罗素A） | Shanghai yuanye Bio-Technology | -- |
| 牛磺酸 | MedChemExpress | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 羧甲基纤维素钠 | -- | -- | |
| 蛋白稳定性实验 | MG132蛋白酶体抑制剂 | -- | -- |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 质粒构建 | Btg2-3xFlag质粒 | Tsingke Biotech | -- |
| Fmo1-His质粒 | Tsingke Biotech | -- | |
| Ufl1-HA质粒 | Tsingke Biotech | -- | |
| Uba5-HA质粒 | Tsingke Biotech | -- | |
| Ufc1-HA质粒 | Tsingke Biotech | -- | |
| Ddrgk1-HA质粒 | Tsingke Biotech | -- | |
| Ub-Myc质粒 | Tsingke Biotech | -- | |
| Ufm1-V5质粒 | Tsingke Biotech | -- | |
| 细胞系 | HEK293T细胞系 | Procell Life Science&Technology Co., Ltd. | -- |
| AML12细胞系 | Procell Life Science&Technology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠HIRI模型 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、年龄（6-8周）、体重（25-28g）、缺血时间（1小时）、再灌注时间（6小时）、缺血范围（70%） 阅读提示：Methods: Mouse HIRI model |
| 细胞缺氧/复氧（H/R）模型 | 缺氧时间（6小时）、复氧时间（6小时）、氧气浓度（1%）、无糖DMEM培养基 阅读提示：Methods: Cell hypoxia/reoxygenation (H/R) model |
| Btg2敲除小鼠构建 | Btg2敲除策略（Cyagen Biosciences）、基因型确认（PCR） 阅读提示：Methods: Animals |
| Btg2转基因小鼠构建 | CAG-LSL-Btg2敲入位点（Gt(ROSA)26Sor）、Alb-Cre小鼠、基因型确认（PCR） 阅读提示：Methods: Animals |
| 腺病毒转染 | 腺病毒类型（ADV7或ADV6）、MOI=50、感染时间（8小时） 阅读提示：Methods: Construction and transfection of adenoviral vectors |
| AAV8注射 | AAV8-TBG-Fmo1或AAV8-TBG-shFmo1、剂量（1.5×10^11 vg）、注射途径（尾静脉）、表达时间（3周） 阅读提示：Methods: Construction and transfection of adeno-associated virus 8 (AAV8) |
| Fmo1过表达/敲低体外实验 | AdFmo1或AdshFmo1、MOI、处理时间、H/R条件 阅读提示：Methods: Construction and transfection of adenoviral vectors; Results: Figure 5 |
| DTA处理 | DTA浓度（体内25mg/kg，口服灌胃，每日一次，连续7天；体外25μM）、溶解溶剂（DMSO储备液、1%羧甲基纤维素钠溶液） 阅读提示：Methods: Reagents intervention |
| 牛磺酸处理 | 牛磺酸浓度（200μg/g体重）、注射途径（尾静脉）、注射时间（HIRI前1小时） 阅读提示：Methods: Reagents intervention |
| 统计学分析 | 统计方法（t检验、ANOVA、Mann-Whitney U检验）、显著性阈值（P<0.05）、样本量（n值） 阅读提示：Methods: Statistical analysis |