单核转录组测序及lncRNA表达特征分析
解析ccRCC中不同细胞类型和亚群的lncRNA表达模式，并评估恶性细胞与正常近端小管细胞的差异。
对20例ccRCC样本和2例NAT进行snRNA-seq，经质量控制后获得94703个细胞核，注释为5大细胞类型和12个亚群。基于元细胞分析lncRNA表达，发现恶性细胞中低丰度lncRNA更广泛但水平更低，并分析CNV与表达的关系。
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透明细胞肾细胞癌中长链非编码RNA的多组学图谱及其表征和临床应用
Multi-Omics Profiling of Long Noncoding RNAs in Clear Cell Renal Cell Carcinoma for Characterization and Clinical Applications.
实验完整度
高整合多组学数据，包含单核转录组、批量转录组、蛋白质组和代谢组，并通过细胞功能实验、代谢检测和皮下荷瘤小鼠模型进行功能与体内验证。
主要模型
786O细胞系 769P细胞系 NCG小鼠皮下移植瘤模型 ccRCC患者队列（100例肿瘤及50例癌旁组织）
重点核对
LINC02532过表达786O细胞系中柠檬酸和ATP水平降低，OCR下降而ECAR不变 LINC02532过表达细胞增殖和侵袭能力降低，且在NCG小鼠皮下移植瘤中肿瘤体积显著减小 DMRlnc模型在TCGA-KIRC队列中AUC为0.93，诊断准确性高 PMRlnc模型在TCGA-KIRC队列中为独立预后因素（HR=1.94），并在IMmotion151和CheckMate队列中呈现风险分层差异 PMRlnc风险分组与免疫治疗反应相关：低风险组在纳武利尤单抗治疗中OS获益，高风险组在阿替利珠单抗+贝伐珠单抗治疗中PFS获益
摘要
透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌中最常见且最致命的亚型，表现出显著的瘤内异质性，并使临床管理复杂化。尽管长链非编码RNA（lncRNAs）调控多种细胞过程，但其在ccRCC中的表达谱和生物标志物潜力仍未被充分定义。在此，我们对100例ccRCC患者队列进行了单核和批量转录组、蛋白质组和代谢组分析。基于元细胞描述了lncRNAs的表达模式。恶性细胞表现出更广泛但更低的lncRNA表达，可能反映了拷贝数变异，而正常上皮细胞中低丰度的lncRNA表现出个体变异性。多组学整合用于建立初步的lncRNA功能推断流程，识别参与代谢和免疫过程的lncRNAs，并通过功能和体内实验验证其作用。筛选出候选生物标志物lncRNAs，构建了诊断（DMRlnc）和预后模型（PMRlnc），并在TCGA、CheckMate和IMmotion151队列中进行了验证。DMRlnc在发现队列和TCGA-KIRC队列中均实现了高诊断准确性（AUC分别为0.98和0.93）。PMRlnc在TCGA-KIRC和IMmotion151队列中将患者分为不同风险组，差异显著（p < 0.0001）。PMRlnc进一步表明，低风险患者可能从纳武利尤单抗中获益更多，而高风险患者可能对阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗反应更好。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ccRCC中lncRNA的表达模式、功能及其作为诊断和预后生物标志物的潜力如何？
- 核心机制
- 恶性细胞中低丰度lncRNA表达更广泛但水平更低，可能反映弥漫性CNV；LINC02532通过抑制氧化磷酸化（OXPHOS）降低ATP和柠檬酸，导致代谢重编程和细胞应激，从而抑制肿瘤增殖；LINC00278可能通过编码微肽YY1BM调节代谢，LNCAROD可能通过调控ST3GAL6影响巨噬细胞迁移，LINC01934可能通过FYB1调控T细胞活化。
- 主要证据
- 多组学数据（snRNA-seq、bulk RNA-seq、蛋白质组、代谢组）分析，结合体外细胞实验（CCK-8、Transwell、代谢检测）和体内皮下移植瘤模型，以及TCGA-KIRC、IMmotion151和CheckMate队列验证的DMRlnc和PMRlnc模型。
- 研究意义
- 研究提供了lncRNA在ccRCC中的系统表征和功能推断框架，并开发了简洁的lncRNA诊断和预后模型，有望改善ccRCC的早期检测、风险分层和个体化治疗决策。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多组学整合的lncRNA功能推断
利用共表达网络和多组学关联初步推断lncRNA的生物学功能，重点识别与代谢和免疫相关的候选lncRNA。
应用hdWGCNA分析各主要细胞类型的共表达模块，结合bulk转录组、代谢组和蛋白质组相关性分析，识别出LINC02532、LINC01060、LINC00278、LNCAROD和LINC01934等候选lncRNA，并预测其参与代谢或免疫过程。
功能验证实验
验证预测的lncRNA（LINC02532和LINC01060）对细胞代谢、增殖、侵袭和体内肿瘤生长的影响。
在786O细胞中过表达LINC02532，检测柠檬酸、ATP、OCR、ECAR、CCK-8增殖、Transwell迁移/侵袭，并在NCG小鼠中建立皮下移植瘤模型；在769P细胞中过表达LINC01060并进行GSEA分析。
诊断模型DMRlnc的构建与验证
构建基于lncRNA的ccRCC诊断模型，并验证其在不同队列中的诊断效能。
利用100例ccRCC和50例NAT的bulk RNA-seq数据，通过Wilcoxon检验获得DElncRNAs（set1），与snRNA-seq lncRNA标记及exoRBase血液外泌体lncRNA取交集，筛选出4个特征lncRNA（MSC-AS1、MIR4435-2HG、CYTOR、LINC00299），经RT-qPCR验证循环中可检测性，并基于逻辑回归构建DMRlnc。
预后模型PMRlnc的构建与验证
构建基于lncRNA的ccRCC预后模型，并评估其风险分层和对免疫治疗反应的预测价值。
基于四亚型间DElncRNAs（set2）与lncRNA标记交集，经RFE选择5个候选特征，最终以3个lncRNA（ADAMTS9-AS1、LINC00671、ENSG00000231204）构建PMRlnc逻辑回归模型。在TCGA-KIRC、IMmotion151和CheckMate队列中验证其预后价值及治疗反应差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Servicebio | G4003 | |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 嘌呤霉素 | BioFroxx | 1299MG025 | |
| 代谢检测 | Amplex Red检测试剂盒 | Beyotime | S0335S |
| ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 | |
| 寡霉素 | MCE | HY-N6782 | |
| OCR检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-F070 | |
| ECAR检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-F069 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Yeasen | 40203ES76 |
| 细胞迁移/侵袭实验 | Transwell小室（8.0微米） | LABSELECT | 14342 |
| 基质胶 | Corning | 2334003 | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | ABclonal | RK20429 |
| RT-qPCR试剂盒 | ABclonal | RK21203 | |
| 体内实验 | NCG小鼠 | GemPharmatech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单核转录组测序 | 样本数：20例ccRCC和2例NAT；细胞核数：94703；过滤条件：<1000 UMIs或>10%线粒体转录本；聚类分辨率：2.3；3000个可变基因；harmony批次校正 阅读提示：Methods: Single-nucleic transcriptome - Processing of snRNA-seq |
| 细胞培养与处理 | 786O和769P细胞系来源（SUNNCELL）；培养基：DMEM或RPMI-1640，10% FBS，100U/mL青霉素，100µg/mL链霉素；嘌呤霉素筛选浓度：786O 4µg/mL，769P 2µg/mL，处理3天；维持浓度减半 阅读提示：Methods: Experiments - Cell lines |
| 代谢功能检测 | 柠檬酸检测使用Amplex Red试剂盒；ATP检测使用Beyotime试剂盒；OCR和ECAR检测使用Elabscience试剂盒，寡霉素浓度1µM；OCR监测90分钟（2分钟间隔），ECAR监测120分钟（4分钟间隔） 阅读提示：Methods: Experiments - Citric acid measurement, ATP measurement, OCR and ECAR |
| 细胞增殖和迁移/侵袭实验 | CCK-8：1000细胞/孔，24/48/72/96/120小时；Transwell：2×10⁵细胞/孔，迁移/侵袭时间16-24小时（786O）和36-72小时（769P） 阅读提示：Methods: Experiments - Cell Counting Kit-8, Transwell migration and invasion assays |
| 体内移植瘤模型 | NCG小鼠（雌性，4周龄）；注射1×10⁷ LINC02532过表达或对照786O细胞；肿瘤体积公式：length×width²/2；每隔3天测量；肿瘤最大允许体积1500mm³或尺寸≥15mm 阅读提示：Methods: Experiments - Subcutaneous implanted tumor model |
| 模型构建与验证 | 训练集75例，测试集25例；DElncRNAs筛选：|log2FC|>1，调整P<0.05；RFE 10折交叉验证重复100次；DMRlnc特征：MSC-AS1, MIR4435-2HG, CYTOR, LINC00299；PMRlnc特征：ADAMTS9-AS1, LINC00671, ENSG00000231204；模型基于逻辑回归 阅读提示：Methods: Model building and testing; Results: Construction and validation of the diagnosis model; Results: Construction and validation of the prognosis model |