临床样本和数据库分析
评估PISD在胃癌组织中的表达及其与预后的关系。
使用UALCAN数据库分析PISD在胃癌和正常组织中的表达，使用Kaplan-Meier Plotter分析PISD表达与生存期的关系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
磷脂酰丝氨酸脱羧酶通过STAT3/GPX4信号通路促进胃癌中的铁死亡
Phosphatidylserine Decarboxylase Promotes Ferroptosis Through STAT3/GPX4 Signaling in Gastric Cancer.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、线粒体功能检测、铁死亡指标检测、体内异种移植模型及转录组分析等多层验证，并进行了机制恢复实验。
主要模型
AGS细胞 MKN45细胞 MGC-803细胞 BALB/c裸鼠异种移植模型
重点核对
细胞系：AGS、MKN45（PISD敲低）、MGC-803（PISD过表达） 处理物及剂量：ML115（20 μM）、Fer-1（2 μM）、LPE（25 μM） 处理时间：48小时（增殖、迁移、铁死亡指标检测）、24小时和48小时（LPE增殖检测） 动物模型：BALB/c裸鼠，皮下接种细胞数（AGS 1×10^7、MKN45 6×10^6、MGC-803 6×10^6） 统计方法：Student's t检验、单因素或双因素方差分析（Tukey事后检验）
摘要
胃癌（GC）仍然是全球主要的健康负担，越来越多的证据表明铁死亡在调节肿瘤细胞存活中发挥重要作用。磷脂酰丝氨酸脱羧酶（PISD）是负责磷脂酰乙醇胺（PE）合成的关键线粒体酶；然而，其在胃癌中的分子功能仍知之甚少。在本研究中，我们提出PISD的下调与GC细胞中铁死亡的增强相关，其通过破坏线粒体PE稳态和损害线粒体功能实现。机制上，PISD缺失降低PE水平，伴随着信号转导与转录激活因子3（STAT3）磷酸化的减少，并降低GPX4表达，导致脂质过氧化增强、铁积累和氧化还原失衡。使用Ferrostatin-1（Fer-1）药理学抑制铁死亡、通过ML115激活STAT3或补充溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）可部分挽救PISD敲低诱导的铁死亡。在体内，PISD下调显著伴随GC异种移植模型中肿瘤生长的减少。总的来说，我们的发现揭示了PISD在连接线粒体磷脂代谢与STAT3/GPX4依赖性铁死亡中的先前未被识别的作用，为胃癌中铁死亡的调控提供了机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PISD在胃癌中的分子功能及其在调控铁死亡和肿瘤进展中的作用是什么？
- 核心机制
- PISD下调减少线粒体PE合成，导致线粒体功能障碍，抑制JAK2/STAT3信号通路，降低GPX4表达，从而促进脂质过氧化和铁死亡。
- 主要证据
- 在AGS和MKN45细胞中敲低PISD增加MDA和Fe2+水平、降低GSH和GPX4表达，并抑制细胞增殖和迁移；在体内，敲低PISD显著减少肿瘤生长；ML115、Fer-1或LPE处理可部分挽救表型。
- 研究意义
- 揭示了PISD通过STAT3/GPX4信号调控铁死亡的新机制，为胃癌治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
验证PISD对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在AGS和MKN45细胞中敲低PISD，在MGC-803细胞中过表达PISD，通过CCK-8、克隆形成和Transwell实验检测细胞行为。
体内异种移植实验
验证PISD对胃癌肿瘤生长的影响。
将PISD敲低或过表达的胃癌细胞皮下注射入裸鼠，监测肿瘤生长。
线粒体功能检测
评估PISD敲低对线粒体功能的影响。
通过Seahorse检测OCR、TMRE检测线粒体膜电位、透射电镜观察线粒体形态、ATP含量检测。
铁死亡指标检测
验证PISD敲低是否诱导铁死亡。
检测MDA、Fe2+、GSH水平和GPX4蛋白表达。
机制验证
探究PISD调控铁死亡的分子机制。
检测STAT3磷酸化水平，并使用ML115激活STAT3、Fer-1抑制铁死亡、LPE补充PE，观察对表型和信号通路的影响。
转录组分析
探索PISD敲低影响的下游信号通路。
对MKN45 shCtrl和shPISD#1细胞进行RNA-seq分析，鉴定差异表达基因和富集通路。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 多聚赖氨酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Cy3标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗 | Proteintech | 1:100 | |
| DAPI | -- | 1:10,000 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Southern Biotech | -- | |
| 成像 | Nikon A1R/A1激光共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗PISD抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-390070 | |
| 抗PISD抗体 | Proteintech | 68484-1-Ig | |
| 抗STAT3抗体 | Proteintech | 60199-1-Ig | |
| 抗pSTAT3抗体 | Proteintech | 60479-1-Ig | |
| 抗GPX4抗体 | Zenoio | R24461 | |
| 抗GAPDH抗体 | Affinity Biosciences | T0004 | |
| 抗JAK2抗体 | Servicebio | GB11325-50 | |
| 抗pJAK2抗体 | Servicebio | GB114585-100 | |
| HRP标记的二抗 | -- | -- | |
| ECL底物 | GE Healthcare | -- | |
| 增强化学发光仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | ABBKINE | -- |
| Fe2+检测 | Fe2+荧光检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| GSH检测 | GSH检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8细胞计数试剂盒 | Dojindo Laboratories | -- |
| 细胞迁移和侵袭 | Transwell小室 | Corning Inc. | -- |
| 基质胶 | Corning Inc. | 1:8稀释 | |
| 慢病毒转染 | 表达shPISD或shCtrl的慢病毒 | Generalbiol | -- |
| 过表达PISD慢病毒 | Genechem | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sangon | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Jiangsu Jicui Yaokang Biological Co., Ltd. | -- |
| PE含量测定 | 细胞线粒体分离试剂盒 | Beyotime | -- |
| PE检测试剂盒 | Merck KGaA | MAK361 | |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜Talo L120C G2 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 线粒体功能分析 | Seahorse XFe24细胞外流量分析仪 | Agilent | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | TMRE染色液 | Beyotime | -- |
| 药物处理 | Ferrostatin-1（Fer-1） | -- | -- |
| ML115 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：AGS、MKN45（RPMI-1640）、MGC-803（DMEM）；培养基补充10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素；培养条件：5% CO2，37°C 阅读提示：Methods 2.1 |
| 慢病毒转染 | 慢病毒：shPISD#1、shPISD#2、shCtrl（Generalbiol），LV-PISD、Vector（Genechem）；筛选：2 μg/mL嘌呤霉素，2周以上 阅读提示：Methods 2.9 |
| 体外功能检测 | CCK-8：3×10^3细胞/孔，处理48小时；克隆形成：800细胞/孔，2周；Transwell：2.5×10^5细胞/mL，48小时 阅读提示：Methods 2.7、2.8 |
| 线粒体功能检测 | Seahorse：3×10^4细胞/孔，Oligomycin 1 μM，FCCP 1 μM，Antimycin & Rotenone 0.5 μM；TMRE：1×10^5细胞/孔，37°C孵育45分钟 阅读提示：Methods 2.14、2.15 |
| 铁死亡指标检测 | MDA、Fe2+、GSH检测的具体操作和波长（MDA 532 nm，Fe2+ 542 nm，GSH 405 nm） 阅读提示：Methods 2.4、2.5、2.6 |
| 体内异种移植 | 小鼠：6周龄雄性BALB/c裸鼠；接种细胞数：AGS 1×10^7、MKN45 6×10^6、MGC-803 6×10^6；监测时间：AGS 35天、MKN45 7周、MGC-803 33天 阅读提示：Methods 2.10 |