体外巨噬细胞炎症小体激活模型
评估EB-WE对NLRP3炎症小体激活的抑制作用
使用LPS和ATP刺激骨髓来源巨噬细胞（BMDM），检测IL-1β和IL-18分泌、NLRP3炎症小体复合物形成及细胞焦亡相关蛋白表达。
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Endarachne binghamiae提取物通过调节NOX-iNOS串扰抑制NLRP3炎症小体激活从而缓解结肠炎
Endarachne binghamiae Extract Alleviates Colitis by Suppressing NLRP3 Inflammasome Activation via Regulation of NOX-iNOS Crosstalk.
实验完整度
高包含体外BMDM模型、体内DSS结肠炎模型及患者转录组数据，并进行了ELISA、Western blot、免疫荧光等功能和机制验证。
主要模型
骨髓来源巨噬细胞（BMDM） DSS诱导的结肠炎小鼠模型（C57BL/6） LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞
重点核对
EB-WE浓度：100和200 µg/mL（体外） LPS和ATP处理浓度及时间：LPS 1 µg/mL（4-5h），ATP 5 mM（30min） DSS浓度及处理时间：2.5%（w/v）自由饮水5天 EB-WE给药剂量及方式：2或5 mg/天口服灌胃 实验重复数：体外和体内实验n=3
摘要
炎症性肠病（IBD）由遗传易感性和慢性炎症触发，先天免疫复合物NLRP3炎症小体的异常激活在其发病机制中起关键作用。本研究在多种炎症模型中研究了褐藻Endarachne binghamiae热水提取物（EB-WE）对NLRP3炎症小体激活的抑制作用，重点关注其抗氧化特性。在骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中，使用LPS和ATP诱导NLRP3炎症小体激活，EB-WE预处理（100、200 µg/mL）显著减少了IL-1β和IL-18的分泌。共聚焦免疫荧光分析进一步证实，EB-WE抑制了NLRP3-ASC/caspase-1复合物的形成。此外，使用DSS诱导的小鼠模型评估了EB-WE的体内抗IBD功效，该模型中结肠炎症和NLRP3介导的反应显著。口服EB-WE（2或5 mg/天）显著改善了临床症状，如体重减轻、腹泻和直肠出血，并显著降低了疾病活动指数（DAI）。EB-WE还降低了血清促炎细胞因子水平以及结肠组织中NLRP3炎症小体相关分子在基因和蛋白水平上的表达。在BMDMs和IBD小鼠模型中，我们进一步分析了涉及NOX2-iNOS的上游调控通路。EB-WE有效抑制了NOX-iNOS轴的激活和NF-κB磷酸化，从而减轻了与DSS诱导的氧化应激和中性粒细胞/巨噬细胞浸润相关的炎症小体激活。总之，这些结果表明EB-WE通过抗氧化机制调节NOX-iNOS轴和NF-κB通路，有效抑制NLRP3炎症小体的形成和激活。这些发现表明，EB-WE有望成为治疗慢性炎症性疾病的新型海洋来源天然治疗剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在探究褐藻Endarachne binghamiae热水提取物（EB-WE）是否通过抗氧化机制抑制NLRP3炎症小体激活，从而缓解DSS诱导的结肠炎。
- 核心机制
- EB-WE通过抑制NOX2/NOX4表达和TXNIP水平，调节NOX-iNOS轴，减少氧化应激和过氧亚硝酸盐生成，进而抑制NF-κB磷酸化和NLRP3炎症小体组装。
- 主要证据
- 在BMDM中，EB-WE降低IL-1β和IL-18分泌及NLRP3-ASC/caspase-1复合物形成；在DSS结肠炎小鼠中，EB-WE改善临床症状并抑制炎症因子和NLRP3相关蛋白表达。
- 研究意义
- EB-WE作为海洋来源天然产物，可能成为治疗慢性炎症性疾病的新型治疗剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外活性成分功能验证
验证EB-WE中主要活性成分对NOX、iNOS和XO活性的影响
在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中，检测EB-WE及化合物pyropheophorbide A和loliolide对NOX活性、iNOS源性NO产生及XO活性的影响。
DSS诱导结肠炎小鼠模型
评估EB-WE在体内对DSS诱导结肠炎的治疗效果
给予小鼠2.5% DSS饮水诱导急性结肠炎，同时口服EB-WE，监测临床评分、组织病理、细胞因子和蛋白表达。
临床和组织学评估
评估EB-WE对DSS结肠炎临床严重程度和组织损伤的影响
每日记录体重、粪便粘稠度和便血评分，计算DAI；结肠组织进行H&E染色评估组织损伤。
氧化还原通路分析
探究EB-WE对氧化应激和抗氧化防御系统的影响
在结肠组织中检测NOX2、NOX4、TXNIP等促氧化蛋白和NQO1、NRF2、HO-1等抗氧化蛋白表达，测定NAD+/NADH和NADP+/NADPH比值及血清3-硝基酪氨酸水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L929细胞条件培养基 | -- | -- | |
| NLRP3炎症小体激活 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | -- | |
| NOX/iNOS/XO活性测定 | 焦脱镁叶绿酸A | Santa Cruz Biotechnology | 24533-72-0 |
| 洛利奥利德 | Sigma-Aldrich | 5989-02-6 | |
| APX-115 | -- | -- | |
| 1400 W | -- | -- | |
| 别嘌呤醇 | -- | -- | |
| NOX活性测定 | 超氧化物比色法试剂盒 | Elabscience | E-BC-K815-M |
| XO活性测定 | 抑制剂筛选试剂盒 | Elabscience | E-BC-D019 |
| ELISA | 小鼠IL-1β/IL-18 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| NAD+/NADH检测 | NAD+/NADH检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K804-M |
| NADP+/NADPH检测 | NADP+/NADPH检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K803-M |
| 免疫荧光 | NLRP3抗体 | Abcam | -- |
| ASC抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| caspase-1 p20抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| DCF-DA | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Zeiss LSM共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- | |
| DSS诱导结肠炎 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| IL-2 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| IL-4 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | -- |
| SAS软件9.4版 | SAS Institute Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外BMDM炎症小体实验 | BMDM分化条件（3月龄雄性C57BL/6小鼠、RPMI+L929条件培养基7天）；LPS浓度（1 µg/mL）和处理时间（4-5小时）；ATP浓度（5 mM）和处理时间（30分钟）；EB-WE预处理浓度（100/200 µg/mL）及预处理时间（1小时） 阅读提示：Materials and Methods 4.2和4.3节 |
| NOX/iNOS/XO活性实验 | RAW 264.7细胞接种密度（1×10^5/孔）；LPS浓度（0.5 µg/mL）和处理时间（12小时）；EB-WE及化合物浓度（EB-WE 100/200 µg/mL、pyropheophorbide A和loliolide 10 µM）；抑制剂浓度（APX-115 10 µM、1400W 100 µM、别嘌呤醇 100 µM） 阅读提示：Materials and Methods 4.4节 |
| DSS诱导结肠炎小鼠模型 | 动物品系、性别、周龄（8周龄雄性C57BL/6小鼠）；DSS浓度（2.5% w/v）和暴露时间（5天+2天恢复）；EB-WE给药剂量（2或5 mg/天）和方式（口服灌胃）；分组（n=10/组） 阅读提示：Materials and Methods 4.8节 |
| 临床和组织学评估 | DAI评分标准（体重减轻、粪便粘稠度、出血）；结肠组织固定和切片条件（10%中性福尔马林，7 µM切片） 阅读提示：Materials and Methods 4.9和4.10节 |
| 氧化还原通路分析 | Western blot抗体列表及稀释度；NAD+/NADH和NADP+/NADPH检测试剂盒（Elabscience）；血清3-NT测量方法 阅读提示：Materials and Methods 4.7节和4.10节 |