2D细胞活力测定
评估RA和Cis单独及联合对Y79和WERI-Rb1细胞活力的影响，确定IC50和最佳联合浓度
将细胞接种于96孔板，用不同浓度的RA（10-400 µM）或Cis（1-100 µM）处理24、48、72小时，MTT法测定活力，计算IC50。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
迷迭香酸与顺铂在视网膜母细胞瘤中的协同抗肿瘤作用：来自2D和3D肿瘤模型的证据
Synergistic Antitumor Effects of Rosmarinic Acid and Cisplatin in Retinoblastoma: Evidence from 2D and 3D Tumor Models.
实验完整度
中包含2D细胞实验、3D球体实验、机制研究（ROS、凋亡基因）及NAC救援实验，但缺乏动物模型和患者样本验证。
主要模型
Y79人视网膜母细胞瘤细胞系 WERI-Rb1人视网膜母细胞瘤细胞系 Y79来源的三维肿瘤球体
重点核对
细胞系Y79 (ATCC® HTB-18™)和WERI-Rb1 (ATCC® HTB-169™)均培养于含10% FBS的RPMI-1640培养基，37°C、5% CO2 RA储存液溶解于DMSO（100 mM），Cis储存液溶解于PBS（1 mM） 2D实验处理时间48小时，各组使用各自48小时IC50浓度 3D球体以3×10^3细胞/孔接种于ULA 96孔板，药物浓度比2D IC50增加20-30%，处理72小时 NAC预处理浓度为5 mM，处理1小时
摘要
背景/目的：视网膜母细胞瘤（RB）是儿童中最常见的原发性眼内恶性肿瘤，其治疗受到化疗耐药和治疗相关毒性的限制。提高常规化疗药物的疗效同时减少剂量相关不良反应至关重要。本研究探讨了天然多酚类化合物迷迭香酸（RA）在RB模型中与顺铂（Cis）联合使用的化疗增敏潜力。方法：使用MTT实验和联合指数（CI）分析评估RA和Cis在Y79和WERI-Rb1 RB细胞系中的抗增殖和协同效应。通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术和细胞内活性氧（ROS）测量分别评估细胞凋亡和氧化应激。利用Y79细胞生成三维（3D）肿瘤球体，通过球体大小分析、基于ATP的活力测定和活/死荧光染色进行体外验证。通过N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理进一步检查细胞毒性的ROS依赖性。通过ELISA分析细胞因子分泌，并通过qRT-PCR评估凋亡相关基因表达。结果：RA和Cis以剂量和时间依赖性方式降低细胞活力，而它们的联合用药诱导显著增强的细胞毒性，由CI值<1证实。联合治疗增加了凋亡细胞群，升高了细胞内ROS，并上调了Caspase-3和Caspase-9。这些效应在3D球体中得以维持，球体尺寸减小且完整性受损。NAC预处理减弱了ROS生成并部分恢复了细胞活力，表明ROS依赖性但不是唯一的细胞毒性贡献。结论：RA通过氧化应激、参与固有（线粒体相关）凋亡信号传导以及减少肿瘤细胞衍生的炎症和血管生成介质，协同增强顺铂诱导的抗癌作用。这些发现强调了RA和Cis组合作为RB治疗化疗增敏策略的潜力，值得进一步进行体内评估。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RA是否能增强Cis在视网膜母细胞瘤细胞中的抗癌效果，其机制是否涉及氧化应激和凋亡信号通路？
- 核心机制
- RA与Cis联合通过增加细胞内ROS、上调Bax/Bcl-2比值和Caspase-3/9表达，激活固有凋亡通路，并抑制肿瘤细胞衍生的炎症和血管生成因子。
- 主要证据
- MTT实验显示剂量和时间依赖性细胞毒性；CI值<1和Bliss分析阳性值证明协同作用；Annexin V/PI流式显示凋亡细胞增加；3D球体尺寸减小和活力降低；NAC预处理逆转ROS和细胞死亡。
- 研究意义
- RA与Cis联合可能作为RB化疗增敏策略，减少Cis剂量及相关毒性，但需要进一步体内验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
药物相互作用分析
定量评估RA和Cis之间是协同、相加还是拮抗作用
使用固定比例组合进行剂量反应实验，Chou-Talalay CI分析和Bliss独立性分析，计算CI、DRI和ΔBliss值。
细胞凋亡检测
评估RA、Cis及联合处理对细胞凋亡的影响
Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞术分析，区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞。
氧化应激和凋亡机制探索
探究联合治疗是否通过ROS和凋亡相关基因诱导细胞死亡
DCFH-DA探针测量细胞内ROS；Caspase-Glo® 3/7活性检测；qRT-PCR检测BAX、BCL2、CASP3、CASP9表达。
3D肿瘤球体模型验证
在更接近体内的3D环境中验证组合治疗的抗肿瘤效果
Y79细胞在ULA 96孔板中形成球体，药物处理72小时后进行形态学观察、直径测量、ATP活力和活/死染色。
ROS依赖性验证（NAC救援实验）
验证ROS在RA+Cis细胞毒性中的因果作用
Y79细胞先用NAC（5 mM）预处理1小时，然后药物处理，检测ROS水平和细胞活力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 迷迭香酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 顺铂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | -- | |
| 细胞活力测定 | MTT试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Inc. | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA | Sigma-Aldrich | -- |
| caspase活性检测 | Caspase-Glo® 3/7活性检测试剂盒 | Promega | -- |
| RNA提取 | TRIzol™试剂 | Invitrogen™ | -- |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems™ | -- |
| qRT-PCR | Power SYBR™ Green PCR预混液 | Applied Biosystems™ | -- |
| 3D培养 | 超低吸附96孔圆底板 | Corning Inc. | -- |
| 3D活力检测 | CellTiter-Glo® 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 活/死染色 | 钙黄绿素-AM | -- | -- |
| 溴化乙锭二聚体-1 | -- | -- | |
| 流式分析 | BD FACSCelesta™流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 显微成像 | 奥林巴斯IX73倒置显微镜 | Olympus Corporation | -- |
| DP74科学CMOS相机 | Olympus Corporation | -- | |
| 酶标仪 | 酶标仪 | BioTek | -- |
| RNA定量 | NanoDrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | StepOnePlus™实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems™ | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | Y79和WERI-Rb1细胞株来源（ATCC），培养条件（RPMI-1640+10% FBS+1%青霉素-链霉素，37°C，5% CO2），细胞代数（第5代） 阅读提示：Methods 2.2 |
| 药物处理 | RA和Cis的浓度范围、溶剂（DMSO/PBS）、储存条件、处理时间 阅读提示：Methods 2.1, 2.3 |
| 联合治疗 | 联合用药的浓度比例、计算CI的方法、固定比例的组合方式 阅读提示：Methods 2.5 |
| 凋亡检测 | Annexin V/PI染色步骤、孵育时间、流式细胞仪设置、分析方法 阅读提示：Methods 2.7, Figure 5 |
| 3D球体模型 | 细胞初始数量、ULA板类型、培养基组成、药物浓度增加比例、处理时间、成像和分析方法 阅读提示：Methods 2.13, Figure 11 |
| ROS依赖性验证 | NAC浓度、预处理时间、后续药物处理浓度和时间 阅读提示：Methods 2.14, Figure 12 |