负载EGF的、富含生物活性的三七来源纳米囊泡加速皮肤伤口愈合

EGF-loaded, bioactive-rich Panax notoginseng-derived nanovesicles accelerate skin wound healing.

作者信息Fei Yu, Guofeng Xie, Jinfeng Zhao, Xiangsheng Zhang, Zhanxue Xu, Xingyu Lu, Xinrui Yang, Peilin Shi, Tian Li, Yu Zhang, Hongbo Chen
PMID41909130
发布时间2026-03-12
DOI10.3389/fcell.2026.1737435

实验完整度

包含体外细胞实验、小鼠皮肤伤口模型、网络药理学分析、LC-MS和miRNA测序等多层级证据,并有功能验证和机制验证。

主要模型

HaCaT人角质形成细胞 L929小鼠成纤维细胞 RAW264.7小鼠巨噬细胞 小鼠皮肤全层伤口模型

重点核对

EGF加载方式:电穿孔(300V/150µF),EGF浓度10μg,PNVs蛋白1mg(0.8mg/mL) EGF封装效率:16.37%±1.574%,通过ELISA测定 细胞实验浓度:PNVs 30μg/mL处理HaCaT细胞 动物模型:8mm全层皮肤缺损,分组包括模型组、PBS组、PNVs组(5mg/kg)、EGF组(8μg/kg)、EGF@PNVs组(5mg/kg),第0和24小时局部给药 统计分析:GraphPad Prism 7.0,p<0.05为显著

摘要

伤口愈合是一个复杂的生理过程,涉及止血、炎症、增殖、迁移和组织重塑。角质形成细胞在伤口床上的迁移受损是非愈合伤口的关键决定因素。在此背景下,植物来源的纳米囊泡(PDNVs)因其高产率、固有的生物相容性、穿越生物屏障的能力以及固有的分子货物(脂质、蛋白质、核酸和植物化学物质)可发挥多靶点效应,已成为有前景的伤口愈合治疗剂。在本研究中,我们筛选了六种PDNVs,发现三七来源的PDNVs(PNVs)显示出优越的促进细胞增殖活性。为了进一步增强PNVs的生物活性,我们通过电穿孔将表皮生长因子(EGF)主动加载到PNVs上(EGF@PNVs)。通过LC-MS和miRNA测序,我们在PNVs中鉴定出丰富的小分子化合物(如人参皂苷Rb1、Rg1)和miRNAs(如miRNA 159)。体外实验表明,PNVs和EGF@PNVs显著增强人角质形成细胞(HACAT)的增殖和迁移以及皮肤机械创伤的修复。此外,它们不仅直接加速小鼠成纤维细胞(L929细胞)的增殖和迁移,还调控小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)分泌TNF-α。该细胞因子随后诱导L929细胞中的成纤维细胞活化或表型调节,进一步增强其增殖和迁移潜力。在小鼠皮肤损伤模型中,两种制剂均加速伤口闭合并发挥免疫调节作用,其中EGF@PNVs的性能始终优于PNVs。总的来说,我们的研究结果将EGF@PNVs介绍为一种天然的、经济有效的、用于伤口管理的传统生物制剂的局部替代品。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
三七来源的纳米囊泡(PNVs)及其负载EGF的制剂(EGF@PNVs)是否能促进皮肤伤口愈合,其机制是什么?
核心机制
PNVs通过其所含小分子化合物(如人参皂苷Rg1、Rb1)和miRNA(如miRNA 159)促进细胞增殖,并诱导巨噬细胞M1极化分泌TNF-α,TNF-α通过调控EMT相关基因(下调E-cadherin,上调N-cadherin、vimentin)激活成纤维细胞,从而间接促进其增殖和迁移;EGF@PNVs通过EGF与PNVs的协同作用增强这些效应。
主要证据
体外实验显示PNVs和EGF@PNVs显著促进HaCaT和L929细胞增殖和迁移;EGF@PNVs处理的巨噬细胞条件培养基促进L929细胞迁移和增殖,且重组TNF-α可模拟该效应;体内小鼠皮肤损伤模型中,EGF@PNVs在第8天达到91.90%的伤口闭合率,显著高于PNVs和EGF单独处理,组织学显示胶原沉积增加、CD3+ T细胞浸润减少。
研究意义
作者提出EGF@PNVs作为天然、经济有效的局部伤口管理替代方案,并指出PDNVs可作为药物递送载体,具有比动物来源纳米囊泡更广阔的应用前景。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PDNVs筛选与表征

筛选具有促增殖活性的植物来源纳米囊泡,并验证其物理和化学特性。

从六种药用植物中提取PDNVs,通过CCK-8筛选对HaCaT细胞的促增殖活性;对PNVs和EGF@PNVs进行TEM、DLS、NTA、zeta电位和BCA蛋白浓度表征。

2

EGF加载与释放特性评估

验证EGF成功加载到PNVs上,并评估其释放和蛋白酶稳定性。

通过电穿孔将EGF加载到PNVs上,ELISA测定封装效率;透析法测定EGF释放曲线;蛋白酶稳定性实验评估EGF@PNVs对胰蛋白酶降解的抵抗能力。

3

细胞摄取实验

验证PNVs和EGF@PNVs被靶细胞摄取的能力。

DIO标记PNVs和EGF@PNVs,与HaCaT和L929细胞共培养,通过激光共聚焦和流式细胞术检测摄取效率。

4

网络药理学和成分分析

预测PNVs的潜在作用靶点和通路,并验证其携带的活性成分。

通过PharmMapper、OMIM、TTD、GeneCards等数据库预测靶点,STRING构建PPI网络,DAVID进行GO/KEGG富集分析;LC-MS检测PNVs中的小分子化合物,miRNA测序鉴定miRNA。

5

体外细胞功能验证

验证PNVs和EGF@PNVs对细胞增殖、迁移和免疫调节的影响。

CCK-8和CFSE染色检测细胞增殖;划痕实验检测迁移;流式检测RAW264.7细胞CD86表达;收集巨噬细胞条件培养基处理L929细胞,qPCR和Western blot检测EMT标志物。

6

体内伤口愈合实验

验证EGF@PNVs在小鼠皮肤损伤模型中的促愈合作用。

建立8mm全层皮肤缺损模型,局部给药,记录伤口闭合率,组织学分析(HE、Masson、免疫组化),流式分析脾脏T细胞亚群,qPCR检测伤口组织细胞因子和胶原基因表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基Gibco--
RPMI 1640培养基Gibco--
胎牛血清Excell--
青霉素/链霉素Gibco--
磷酸盐缓冲液----
马尔文Zetasizer Pro分析仪Malvern--
蔡司LSM 880 NLO透射电子显微镜ZEISS--
纳米颗粒追踪分析(NS300)Malvern Panalytical--
BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0009
内毒素检测试剂盒BOKANG BIOBK-T04
表皮生长因子----
ELISA试剂盒Elabscience--
DIO染料Beyotime--
RNA miRNeasy Micro试剂盒Qiagen--
Quantus荧光计Promega--
Qsep100BIOptic--
用于Illumina的多重小RNA文库制备试剂盒NEB--
Illumina Novaseq测序系统Illumina--
GP-transfect-Mate转染试剂Gene Pharma--
CCK-8检测试剂盒Beyotime--
CFSE染料BioLegend--
重组TNF-αNovoproteinCF09
RIPA裂解液Yeasen Biotechnology20120ES60
蛋白酶抑制剂Yeasen Biotechnology20124ES03
PVDF膜Millipore--
GAPDH抗体AbmartP60037
E-钙黏蛋白抗体AbmartTA0131
N-钙黏蛋白抗体AbmartT55015
波形蛋白抗体AbmartT55134
HRP标记的二抗AbmartB30009
ECL化学发光试剂盒Protein TechPK10003
TRIzol试剂TaKaRa--
SuperMix逆转录试剂盒TransGen--
2×SYBR Green qPCR MixTransGen--
QuantStudio five系统Thermo--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
PDNVs分离
离心速度和时间:3,000g 20min,10,000g 40min,40,000g 70min,150,000g 90min;组织与PBS比例1:2;0.22μm过滤
阅读提示:Methods 2.2 PDNVs isolation
EGF加载
电穿孔参数:300V/150µF;PNVs蛋白浓度0.8mg/mL;EGF浓度0.8μg/mL;封装效率计算
阅读提示:Methods 2.4 EGF loading and encapsulation efficiency
体外细胞实验
细胞系:HaCaT、L929、RAW264.7;PNVs处理浓度30μg/mL;划痕实验时间24h;条件培养基制备(PNVs处理RAW264.7 24h后收集)
阅读提示:Methods 2.1 Cell culture, 2.11 Cell proliferation, 2.12 Scratch assay, 2.13 Conditioned medium collection
动物实验
小鼠品系(文中未明确说明);8mm全层皮肤缺损;分组及剂量:模型组、PBS组(5mL/kg)、PNVs组(5mg/kg)、EGF组(8μg/kg)、EGF@PNVs组(5mg/kg);给药时间点:0和24h;取材时间:第9天
阅读提示:Methods 2.16 Mouse skin wound model
统计分析
统计分析软件:GraphPad Prism 7.0;显著性阈值p<0.05;组间比较方法:双尾t检验或单因素方差分析(Tukey事后检验)
阅读提示:Methods 2.18 Statistical analysis