PDNVs筛选与表征
筛选具有促增殖活性的植物来源纳米囊泡,并验证其物理和化学特性。
从六种药用植物中提取PDNVs,通过CCK-8筛选对HaCaT细胞的促增殖活性;对PNVs和EGF@PNVs进行TEM、DLS、NTA、zeta电位和BCA蛋白浓度表征。
EGF-loaded, bioactive-rich Panax notoginseng-derived nanovesicles accelerate skin wound healing.
包含体外细胞实验、小鼠皮肤伤口模型、网络药理学分析、LC-MS和miRNA测序等多层级证据,并有功能验证和机制验证。
HaCaT人角质形成细胞 L929小鼠成纤维细胞 RAW264.7小鼠巨噬细胞 小鼠皮肤全层伤口模型
EGF加载方式:电穿孔(300V/150µF),EGF浓度10μg,PNVs蛋白1mg(0.8mg/mL) EGF封装效率:16.37%±1.574%,通过ELISA测定 细胞实验浓度:PNVs 30μg/mL处理HaCaT细胞 动物模型:8mm全层皮肤缺损,分组包括模型组、PBS组、PNVs组(5mg/kg)、EGF组(8μg/kg)、EGF@PNVs组(5mg/kg),第0和24小时局部给药 统计分析:GraphPad Prism 7.0,p<0.05为显著
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选具有促增殖活性的植物来源纳米囊泡,并验证其物理和化学特性。
从六种药用植物中提取PDNVs,通过CCK-8筛选对HaCaT细胞的促增殖活性;对PNVs和EGF@PNVs进行TEM、DLS、NTA、zeta电位和BCA蛋白浓度表征。
验证EGF成功加载到PNVs上,并评估其释放和蛋白酶稳定性。
通过电穿孔将EGF加载到PNVs上,ELISA测定封装效率;透析法测定EGF释放曲线;蛋白酶稳定性实验评估EGF@PNVs对胰蛋白酶降解的抵抗能力。
验证PNVs和EGF@PNVs被靶细胞摄取的能力。
DIO标记PNVs和EGF@PNVs,与HaCaT和L929细胞共培养,通过激光共聚焦和流式细胞术检测摄取效率。
预测PNVs的潜在作用靶点和通路,并验证其携带的活性成分。
通过PharmMapper、OMIM、TTD、GeneCards等数据库预测靶点,STRING构建PPI网络,DAVID进行GO/KEGG富集分析;LC-MS检测PNVs中的小分子化合物,miRNA测序鉴定miRNA。
验证PNVs和EGF@PNVs对细胞增殖、迁移和免疫调节的影响。
CCK-8和CFSE染色检测细胞增殖;划痕实验检测迁移;流式检测RAW264.7细胞CD86表达;收集巨噬细胞条件培养基处理L929细胞,qPCR和Western blot检测EMT标志物。
验证EGF@PNVs在小鼠皮肤损伤模型中的促愈合作用。
建立8mm全层皮肤缺损模型,局部给药,记录伤口闭合率,组织学分析(HE、Masson、免疫组化),流式分析脾脏T细胞亚群,qPCR检测伤口组织细胞因子和胶原基因表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Excell | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| PDNVs分离 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 表征 | 马尔文Zetasizer Pro分析仪 | Malvern | -- |
| 蔡司LSM 880 NLO透射电子显微镜 | ZEISS | -- | |
| 纳米颗粒追踪分析(NS300) | Malvern Panalytical | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| 内毒素检测试剂盒 | BOKANG BIO | BK-T04 | |
| EGF加载 | 表皮生长因子 | -- | -- |
| ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 细胞摄取 | DIO染料 | Beyotime | -- |
| miRNA测序 | RNA miRNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| Quantus荧光计 | Promega | -- | |
| Qsep100 | BIOptic | -- | |
| 用于Illumina的多重小RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| Illumina Novaseq测序系统 | Illumina | -- | |
| miRNA转染 | GP-transfect-Mate转染试剂 | Gene Pharma | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| CFSE染料 | BioLegend | -- | |
| 细胞处理 | 重组TNF-α | Novoprotein | CF09 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Yeasen Biotechnology | 20120ES60 |
| 蛋白酶抑制剂 | Yeasen Biotechnology | 20124ES03 | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| GAPDH抗体 | Abmart | P60037 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Abmart | TA0131 | |
| N-钙黏蛋白抗体 | Abmart | T55015 | |
| 波形蛋白抗体 | Abmart | T55134 | |
| HRP标记的二抗 | Abmart | B30009 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Protein Tech | PK10003 | |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| SuperMix逆转录试剂盒 | TransGen | -- | |
| 2×SYBR Green qPCR Mix | TransGen | -- | |
| QuantStudio five系统 | Thermo | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDNVs分离 | 离心速度和时间:3,000g 20min,10,000g 40min,40,000g 70min,150,000g 90min;组织与PBS比例1:2;0.22μm过滤 阅读提示:Methods 2.2 PDNVs isolation |
| EGF加载 | 电穿孔参数:300V/150µF;PNVs蛋白浓度0.8mg/mL;EGF浓度0.8μg/mL;封装效率计算 阅读提示:Methods 2.4 EGF loading and encapsulation efficiency |
| 体外细胞实验 | 细胞系:HaCaT、L929、RAW264.7;PNVs处理浓度30μg/mL;划痕实验时间24h;条件培养基制备(PNVs处理RAW264.7 24h后收集) 阅读提示:Methods 2.1 Cell culture, 2.11 Cell proliferation, 2.12 Scratch assay, 2.13 Conditioned medium collection |
| 动物实验 | 小鼠品系(文中未明确说明);8mm全层皮肤缺损;分组及剂量:模型组、PBS组(5mL/kg)、PNVs组(5mg/kg)、EGF组(8μg/kg)、EGF@PNVs组(5mg/kg);给药时间点:0和24h;取材时间:第9天 阅读提示:Methods 2.16 Mouse skin wound model |
| 统计分析 | 统计分析软件:GraphPad Prism 7.0;显著性阈值p<0.05;组间比较方法:双尾t检验或单因素方差分析(Tukey事后检验) 阅读提示:Methods 2.18 Statistical analysis |