HSP70重组蛋白的制备与鉴定
制备并鉴定鸟分枝杆菌亚种副结核病的重组HSP70蛋白，确保其用于后续偶联。
将HSP70基因克隆至pET-24a质粒，在大肠杆菌BL21中表达，使用钴螯合树脂和去内毒素试剂盒纯化，并通过SDS-PAGE和Western blot验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抗体与热休克蛋白70的偶联激活针对肿瘤细胞的免疫应答
The Conjugation of Antibodies to Heat Shock Protein 70 Activates Immune Responses Against Tumor Cells.
实验完整度
高包含体外细胞系实验、补体固定实验、小鼠异种移植瘤模型及组织病理学和免疫组化分析，涉及功能性验证和机制验证。
主要模型
MCF-7人乳腺癌细胞系 LS174T人结肠癌细胞系 HEK293T人胚肾细胞系（正常对照） BALB/c免疫抑制小鼠异种移植瘤模型
重点核对
细胞系：MCF-7（HTB-22）、LS174T（CL-188）、HEK293T（CRL-1573） 处理剂量：抗体-HSP70偶联物250 μg/mL（100 μL），每两天一次，共三次 处理时间：LS174T肿瘤接种后第4天开始，MCF-7肿瘤接种后第5天开始 样本量：每组4只小鼠 体内模型：免疫抑制BALB/c小鼠经全身照射3 Gy后皮下接种2×10^6细胞
摘要
目的：分枝杆菌的热休克蛋白（HSPs）已被鉴定为具有伴侣功能的免疫原性抗原。本研究评估了一种利用来自鸟分枝杆菌亚种副结核病的HSP70偶联商业抗体来增强宿主针对癌细胞的免疫应答的方法。方法：将重组HSP70与单克隆抗体曲妥珠单抗和贝伐珠单抗偶联，用于肿瘤细胞的体内和体外治疗。在表征细胞靶标表达后，评估了抗体-HSP70复合物对MCF-7、LS174T和HEK293T细胞系的细胞毒性。使用补体固定实验检测补体激活通路的刺激作用。在小鼠异种移植LS174T和MCF-7肿瘤中评估了HSP70-抗体的体内效应。通过组织病理学分析评估肿瘤组织。结果：抗体-HSP70复合物的细胞毒效应显著大于其他处理对MCF-7和LS174T细胞系的作用；在存在人血浆和白细胞样本的情况下，这种效应得到了证实。此外，HSP70抗体已证明激活经典补体途径。用抗体-HSP70复合物治疗异种移植肿瘤显著降低了肿瘤重量和生长速率，并降低了血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）的表达。组织病理学分析以及观察到的治疗效果证实了该方法的安全性。结论：总之，通过靶向先天免疫应答刺激免疫系统对抗癌细胞，可以增强靶向治疗的效果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在评估将鸟分枝杆菌亚种副结核病的HSP70与单克隆抗体曲妥珠单抗或贝伐珠单抗偶联后，能否通过激活先天免疫应答增强对肿瘤细胞的杀伤效应。
- 核心机制
- 抗体-HSP70偶联物通过激活经典补体途径和白细胞（包括ADCC和CDC）增强对肿瘤细胞的细胞毒性，并可能通过模式识别受体如TLR-2激活先天免疫细胞。
- 主要证据
- 体外实验显示，与单独抗体相比，抗体-HSP70偶联物在加入人血清或白细胞时显著降低MCF-7和LS174T细胞活力；补体固定实验表明该偶联物激活补体；体内实验中，偶联物处理显著降低异种移植肿瘤的重量和生长速率，并减少CD31表达和血管密度。
- 研究意义
- 研究表明，通过靶向先天免疫应答刺激免疫系统对抗癌细胞，可能增强靶向治疗的有效性，为癌症免疫治疗提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗体-HSP70偶联物的制备与纯化
将HSP70与单克隆抗体曲妥珠单抗和贝伐珠单抗共价偶联，并纯化偶联产物。
使用EDC/NHS偶联法将HSP70与抗体连接，通过Sephadex G-150凝胶过滤纯化，并用SDS-PAGE和Western blot确认偶联。
细胞表面靶标表达表征
验证三种细胞系上HER2、VEGFR1、VEGFR2和膜结合HSP70的表达情况，以确定抗体作用的靶标。
使用流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞表面标志物表达。
体外细胞毒性评估
评估抗体-HSP70偶联物在存在人血清或白细胞时对肿瘤细胞的杀伤作用。
将细胞与抗体-HSP70偶联物、单独抗体或HSP70处理，加入人血浆（5%）或白细胞（10,000 cells/mL），24小时后进行MTT实验。
补体固定试验
检测抗体-HSP70偶联物是否激活补体系统，尤其是经典途径。
将细胞与偶联物或对照孵育，后加入混合人血清，再加入致敏绵羊红细胞，检测红细胞裂解程度。
体内抗肿瘤效应评估
评估抗体-HSP70偶联物在小鼠异种移植肿瘤模型中的抗肿瘤效果。
在免疫抑制BALB/c小鼠皮下接种LS174T或MCF-7细胞，待肿瘤体积达30 mm³后分为4组，分别给予抗体、抗体-HSP70偶联物、HSP70或PBS处理，每两天一次共三次，测量肿瘤大小和重量。
组织病理学与免疫组化分析
评估治疗的安全性和对肿瘤微环境的影响，包括肿瘤坏死、纤维化和血管生成。
摘取肿瘤及主要器官，固定后进行H&E染色和Masson三色染色，并通过免疫组化检测CD31表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体偶联 | MES缓冲液 | Sigma Aldrich | 69892 |
| EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺） | -- | -- | |
| NHS（N-羟基琥珀酰亚胺） | -- | -- | |
| 曲妥珠单抗 | AryoGen Pharmed | -- | |
| 贝伐珠单抗 | AryoGen Pharmed | -- | |
| 纯化 | Sephadex G-150凝胶 | Sigma Aldrich | G15050 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 流式分析 | APC偶联的ErbB-2（Her-2/CD340）抗体 | Miltenyi Biotec | 130-124-474 |
| APC偶联的VEGFR-1（Flt-1）抗体 | Miltenyi Biotec | 130-120-776 | |
| APC偶联的CD309（VEGFR-2）抗体 | Miltenyi Biotec | 130-117-984 | |
| FITC偶联的抗人cmHsp70.1抗体 | multimmune GmbH | -- | |
| SYTOX™ Blue染料 | Invitrogen | -- | |
| 共聚焦显微镜 | µ-Slide 8孔腔室载玻片 | ibidi GmbH | -- |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SDS-PAGE | 蛋白分子量标准 | Sinaclone | SL7001 |
| Western blotting | PVDF膜 | Elabscience | E-BC-R266 |
| 4-氯-1-萘酚 | Sigma Aldrich | C8890 | |
| HRP偶联的山羊抗兔抗体 | ImmunoChemistry Technologies | -- | |
| ELISA | 酶标板 | Biofile | -- |
| TMB底物 | -- | -- | |
| Western blotting | 小型Trans-Blot电转印槽 | Bio-Rad | -- |
| 流式分析 | MACSQuant Analyzer 9流式细胞仪 | Miltenyi Biotec | -- |
| 共聚焦显微镜 | Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| ELISA | 分光光度计 | AccuReader | -- |
| 动物实验 | Elekta紧凑型直线加速器 | Elekta Solutions AB | -- |
| 免疫组化 | Tris缓冲盐溶液 | Sigma | P5912 |
| 一抗（ORB10314） | -- | ORB10314 | |
| 连接液 | Diagnostic BioSystems | PVP1000D | |
| 聚合物溶液 | Diagnostic BioSystems | PVP1000D |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HSP70制备 | HSP70基因（AF254578）、表达载体pET-24a、宿主菌株E. coli BL21、纯化方法 阅读提示：见Materials and Methods中“Preparation of HSP70” |
| 抗体偶联 | 偶联试剂浓度（EDC 4 mg/mL、NHS 6 mg/mL）、HSP70浓度250 μg/mL、抗体浓度1 mg/mL、缓冲液和孵育时间 阅读提示：见Materials and Methods中“Conjugation of HSP70 to Antibodies” |
| 细胞培养 | 细胞系（MCF-7、LS174T、HEK293T）、培养基（DMEM+10% FBS）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：见Materials and Methods中“Cell Culture” |
| 体外细胞毒性实验 | 处理浓度10 μg/mL、血清比例5%、白细胞浓度10,000 cells/mL、MTT浓度0.5 mg/mL、孵育时间24小时、重复数 阅读提示：见Materials and Methods中“In-vitro Cytotoxicity Assay” |
| 补体固定试验 | 细胞量1×10^6个/管、处理浓度20 μg/mL、血清量100 μL、孵育时间1小时、致敏红细胞浓度1% 阅读提示：见Materials and Methods中“Complement Fixation Test” |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c雌性）、免疫抑制方法（3 Gy全身照射）、细胞接种量（2×10^6）、治疗剂量（25 μg/只）、给药方案（每两天一次共3次） 阅读提示：见Materials and Methods中“Tumor Induction in Mice”和“Treatment of Xenograft Tumors” |