体内抗肿瘤效果评估
评估ATST对AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠模型的肿瘤抑制作用
建立AOM/DSS诱导的结直肠癌模型，分组为WT、MODEL和ATST组，ATST组在DSS处理期间隔日口服10 mg/kg ATST，100天后处死，收集结肠组织，分析肿瘤数量、负荷、H&E、TUNEL和Ki67染色。
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阿托伐他汀通过FDFT1介导的PI3K/AKT通路抑制促进结直肠癌脂质分解
Atorvastatin promotes lipid catabolism in colorectal cancer via FDFT1‒mediated inhibition of the PI3K/AKT pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8、克隆形成、EdU、流式）、体内小鼠模型（AOM/DSS和皮下移植瘤）、转录组分析（RNA-seq）、临床样本验证及机制验证（过表达/敲低、通路抑制）等多个独立证据层级。
主要模型
C57BL/6小鼠AOM/DSS诱导结直肠癌模型 Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型（HCT116细胞） 人结直肠癌细胞系HCT116和SW480 人正常肠上皮细胞系NCM460 结直肠癌患者组织样本（30例）
重点核对
ATST浓度和处理时间（IC50浓度，24-96小时） FDFT1过表达和敲低的慢病毒载体 PI3K抑制剂LY294002的使用 AOM/DSS诱导模型（AOM 10 mg/kg，DSS 1%-2%）和皮下移植模型（HCT116细胞1×10^6） 统计分析（one-way ANOVA、非配对t检验）
摘要
作为一种羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，阿托伐他汀因其抗肿瘤作用而受到广泛关注。然而，其具体作用机制仍不完全清楚。在我们的研究中，发现阿托伐他汀能抑制AOM/DSS诱导的小鼠结直肠癌进展。机制上，通过抑制HMGCR并消耗细胞胆固醇，阿托伐他汀激活SREBP2-FDFT1轴。这进而抑制PI3K/AKT通路，诱导内质网应激和自噬，同时促进脂质分解以驱动铁死亡。本研究阐明了阿托伐他汀调节脂质分解以影响结直肠癌进展的机制，为结直肠癌治疗提供了新方向。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 阿托伐他汀如何通过调节脂质代谢抑制结直肠癌进展？
- 核心机制
- ATST通过抑制HMGCR消耗胆固醇，激活SREBP2-FDFT1轴，进而抑制PI3K/AKT通路，诱导内质网应激和自噬，促进脂质分解和铁死亡。
- 主要证据
- 体外细胞实验（CCK-8、克隆形成、EdU、流式）显示ATST抑制增殖、诱导凋亡和铁死亡；体内AOM/DSS模型和皮下移植瘤模型验证了ATST的肿瘤抑制效果；FDFT1过表达和敲低实验以及PI3K抑制剂LY294002验证了FDFT1-PI3K/AKT轴的机制。
- 研究意义
- 阐明ATST调节脂质分解影响结直肠癌进展的机制，为结直肠癌治疗提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞增殖和毒性检测
评估ATST对CRC细胞增殖和存活的影响
使用CCK-8检测正常细胞NCM460和CRC细胞HCT116、SW480的细胞活力，计算IC50，随后在IC50浓度下进行96小时增殖实验、克隆形成、EdU染色和SYTOX染色。
转录组分析及FDFT1表达验证
鉴定ATST处理后差异表达基因，并验证FDFT1的表达变化及其与CRC进展的关系
对ATST处理的HCT116细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因，通过IF、Western blot验证FDFT1表达，并利用GEO、TCGA数据库和临床样本分析FDFT1表达与预后。
脂质代谢和SREBP2-FDFT1轴验证
验证ATST降低胆固醇水平并激活SREBP2-FDFT1轴
通过BODIPY染色、胆固醇酯检测、油红O染色评估脂质含量；通过Western blot检测SREBP2核转位和FDFT1、SQLE表达，并加入外源性胆固醇观察逆转效应。
内质网应激、自噬和细胞死亡检测
验证ATST诱导的内质网应激、自噬、凋亡和细胞周期阻滞
通过Western blot检测IRE1-XBP1和PERK-ATF4通路，检测Ca2+水平、XBP-1s表达、JC-1、ROS、细胞周期和凋亡相关蛋白。
FDFT1过表达和敲低的功能研究
验证FDFT1在ATST诱导的ER应激和脂质分解中的作用
通过慢病毒介导FDFT1过表达和敲低，检测细胞增殖、ER应激、自噬、凋亡、脂质含量等变化，并使用PI3K抑制剂LY294002进行回复实验。
体内皮下移植瘤模型验证
验证FDFT1在体内肿瘤生长中的作用及ATST的治疗效果
将shNC和shFDFT1的HCT116细胞皮下注射到裸鼠，分组接受ATST或生理盐水处理，测量肿瘤体积和重量，并进行组织学分析。
铁死亡机制验证
验证ATST是否诱导铁死亡
检测GPX4和NRF2表达、Fe2+、MDA、GSH水平，并通过透射电镜观察线粒体结构变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 阿托伐他汀 | MedChemExpress | HY-17379 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Bio-Channel | -- |
| DMEM培养基 | Bio-Channel | -- | |
| 胎牛血清 | Bio-Channel | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Bio-Channel | -- | |
| EdU实验 | EdU工作液 | Yakecen | KTA2031 |
| 流式分析 | DCFH-DA探针 | Yesen | 50101ES01 |
| JC-1工作液 | Yesen | 717164ES03 | |
| PI/RNase A工作液 | KeyGEN BioTECH | KGA9101 | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGA1102 |
| 钙离子检测 | Fluo-4 AM | Beyotime | S1061S |
| 胆固醇酯检测 | 胆固醇酯检测试剂盒 | Beyotime | S0211S |
| 铁离子检测 | 铁离子检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K881-M |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| PMSF | -- | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | KeyGEN BioTECH | KGB2101 | |
| SDS-PAGE凝胶电泳 | Bio-Rad | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| SuperKine™超敏ECL底物 | Abbkine | BMU102 | |
| RNA提取 | Freezol试剂 | Vazyme | R711 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂 | -- | -- |
| 免疫荧光 | CoraLite488标记的山羊抗兔二抗 | Proteintech | -- |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 动物模型 | 氧化偶氮甲烷 | MedChemExpress | HY-111375 |
| 葡聚糖硫酸钠 | Tuoran Biotech | 0216011080 | |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131S |
| Western blot | Western和IP细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞培养 | 细胞系来源、培养基（RPMI-1640或DMEM）、血清和抗生素浓度、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Methods - Cell lines |
| 药物处理 | ATST浓度（IC50）、处理时间（24-96小时） 阅读提示：Methods - Cell viability assay, Figure 2 |
| 体内AOM/DSS模型 | 小鼠品系、性别、年龄、AOM剂量、DSS浓度和周期、ATST给药方案 阅读提示：Methods - Establishment of mouse models, AOM/DSS-induced colitis-associated tumor model |
| 体内皮下移植瘤模型 | 小鼠品系、年龄、细胞系和数量、shRNA载体、ATST给药方案 阅读提示：Methods - Establishment of mouse models, Subcutaneous xenograft tumour model |
| FDFT1过表达和敲低 | 慢病毒载体构建、转染方法、敲低效率验证 阅读提示：Methods - Western blot analysis, Supplementary Figures 2 and 4 |
| PI3K/AKT通路验证 | LY294002浓度和处理时间、CETSA实验条件 阅读提示：Results - ATST inhibits the PI3K/AKT signalling pathway, Figure 7 |
| 铁死亡检测 | Fer-1浓度、Fe2+、MDA、GSH检测试剂盒和操作步骤、TEM观察条件 阅读提示：Results - ATST triggers a ferroptosis-like cell death, Figure 9, Methods |