构建CtDeg系统
验证靶标诱导的荧光激活原理，即荧光仅在目标RNA存在时产生。
构建n*GFP–dLwaCas13a–tDeg融合蛋白，并将Pepper基序嵌入crRNA支架生成环形Pepper–crRNA；在HEK 293T细胞中表达，通过突变NEAT1_1或表达外源N RNA验证荧光激活。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
可编程、靶标诱导的荧光CRISPR-tDeg平台用于活细胞RNA可视化
Programmable, target-induced fluorogenic CRISPR-tDeg platform for live-cell RNA visualization.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HEK293T、Vero E6）、内源RNA成像、RNA-FISH验证、MS2系统对照、结构建模与对接、病毒trVLP感染模型等多层级验证。
主要模型
HEK 293T细胞 Vero E6细胞 Caco-2-N细胞 SARS-CoV-2 trVLP感染模型
重点核对
NEAT1_1缺失HEK 293T细胞模型（Cas9介导） SARS-CoV-2 N RNA稳定表达HEK 293T细胞系 G3 tDeg变体的激活比（~9倍） NEAT1_2 RNA-FISH共定位（Pearson系数和Manders系数） SARS-CoV-2 trVLP感染Vero E6细胞的活细胞成像
摘要
RNA分子在结构、动力学和功能上表现出显著的异质性，然而在活细胞中对其进行精确可视化的方法仍然有限。虽然基于CRISPR的RNA成像具有巨大潜力，但现有系统常常因组成型信号发射或非特异性结合而遭受高背景荧光。为克服这些挑战，我们开发了CtDeg（CRISPR–dCas13–tDeg），一种模块化的RNA成像平台，将荧光激活直接与靶标RNA识别偶联，同时利用降解决定子介导的降解来抑制背景信号。通过工程化crRNA支架以嵌入Pepper RNA基序，CtDeg确保仅在结合天然RNA靶标时才产生荧光。我们系统优化了C端tDeg变体以最大化信噪比，并证明CtDeg相比传统的荧光蛋白–CRISPR RNA成像方法具有显著更低的背景和更高的特异性。利用CtDeg，我们捕获了实时paraspeckle组装动态，并可视化了SARS-CoV-2基因组RNA的早期转运。值得注意的是，CtDeg提供了病毒诱导的NEAT1_2 lncRNA积累的首个直接成像证据，揭示了宿主-病毒调控相互作用。除这些应用外，CtDeg与多种Cas13直系同源物和荧光蛋白兼容，建立了一个多功能、靶标诱导的平台，用于探测活细胞中RNA的定位、动力学和功能，在合成生物学和RNA生物学中具有广泛应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现高特异性、低背景的活细胞RNA成像，无需对目标RNA进行修饰？
- 核心机制
- CtDeg通过将Pepper基序嵌入crRNA支架，仅在靶标RNA识别时激活Pepper折叠，从而稳定荧光蛋白-降解决定子融合蛋白，抑制非特异性背景；靶标诱导的降解抑制实现荧光激活。
- 主要证据
- 在HEK 293T和Vero E6细胞中，通过内源NEAT1_1/NEAT1_2、外源SARS-CoV-2 N RNA成像，结合RNA-FISH、MS2系统对照、流式细胞术和结构建模验证，CtDeg表现出靶标依赖的荧光激活和低背景。
- 研究意义
- CtDeg可作为通用的活细胞RNA成像平台，用于研究RNA定位、动态和功能，并在合成生物学和RNA生物学中具有应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化tDeg模块
提高信噪比，降低背景荧光并增强靶标诱导信号。
构建多种tDeg变体（Y、I、G、g系列），通过流式细胞术和共聚焦成像评估激活比，挑选最优变体G3。
验证内源RNA成像特异性
验证CtDeg对核内长链非编码RNA的内源成像能力。
使用NLS标记的n*GFP–dLwaCas13a–G3靶向NEAT1_2，结合免疫荧光和RNA-FISH验证共定位。
评估灵敏度与泛用性
测试CtDeg对低丰度转录本的检测灵敏度以及不同Cas13和报告蛋白的兼容性。
靶向FOS和MYC内源转录本，比较荧光信号；并测试dLwaCas13a、dPspCas13b、dRfxCas13d与n*GFP、Venus、mCherry的组合。
评估生物相容性
检测CtDeg表达对细胞活力和内源RNA稳定性的影响。
进行CCK-8细胞活力检测，检测MYC mRNA的衰减动态，以及凋亡分析。
比较与现有系统
对比CtDeg与MS2-MCP和CRISPR-Csm系统的信噪比和背景荧光。
使用外源SARS-CoV-2 N RNA（3×MS2标签）比较CtDeg与MCP/MS2；使用HSPA1A比较CtDeg与CRISPR-Csm系统。
实时追踪RNA动态
利用CtDeg可视化核内paraspeckle动态和病毒RNA转运。
在稳定表达n*GFP–dLwaCas13a–G3的Vero E6细胞中，转染靶向NEAT1_2的crRNA成像paraspeckle，或感染SYTO Deep Red标记的SARS-CoV-2 trVLP追踪病毒RNA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA提取和RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | Magen Biotech | -- |
| 一步法RT-qPCR试剂盒 | Vazyme Biotech | -- | |
| RT-qPCR | Bio-Rad CFX系统 | Bio-Rad | -- |
| 活细胞成像 | Hoechst 33342染料 | Beyotime | -- |
| Nikon AX激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| Nikon CSU-W1转盘共聚焦系统 | Nikon | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX S流式细胞仪 | Beckman | -- |
| FlowJo软件 | FlowJo | -- | |
| 稳定细胞系分选 | FACSAria III分选仪 | BD Biosciences | -- |
| Western blotting | WB裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| Bio-Rad Mini PROTEAN电泳系统 | Bio-Rad | -- | |
| 半干转印仪 | Bio-Rad | -- | |
| 兔抗sfGFP抗体 | HUABIO | -- | |
| 兔抗N蛋白抗体 | Sino Biological | -- | |
| 小鼠抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 增强化学发光底物 | -- | -- | |
| 化学发光成像仪 | Analytic Jena | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | -- |
| 5%牛血清白蛋白 | Fdbio | -- | |
| 兔抗NONO抗体 | Affinity | -- | |
| Alexa Fluor 647偶联二抗 | Abcam | -- | |
| DAPI染料 | Beyotime | -- | |
| CRISPR-Cas9介导的基因破坏 | PX459质粒 | Addgene | 62988 |
| RNA-FISH | Cy3标记DNA寡核苷酸探针 | Sangon Biotech | -- |
| RNA荧光原位杂交试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | Apexbio | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V和碘化丙啶染色 | Elabscience | E-CK-A239 |
| 病毒浓缩 | 聚乙二醇6000 | -- | -- |
| 氯化钠 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| 病毒荧光标记 | SYTO Deep Red染料 | Thermo Fisher | -- |
| PD MiniTrap G-25脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| 结构建模 | AlphaFold3 | -- | -- |
| 分子对接 | HADDOCK 2.4 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系（HEK 293T、Vero E6、Caco-2-N），培养基（DMEM, 10% FBS, 1% P/S），转染试剂（Lipofectamine 3000），细胞汇合度（~80%-85%），种子密度（HEK 293T: 4×10^5/孔；Vero E6: 2×10^5/孔） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and transfection |
| 质粒构建 | 表达载体（pcDNA3.1(+)），荧光蛋白（n*GFP, Venus, mCherry），Cas13变体（dLwaCas13a, dPspCas13b, dRfxCas13d），degron/tDeg变体，crRNA表达载体（pAV-U6+27），启动子（CMV, MiniCMV, U6） 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction; Supplementary Fig. S1 |
| RNA提取与RT-qPCR | RNA提取试剂盒（Magen Biotech），RT-qPCR试剂盒（Vazyme Biotech），循环条件（50°C 5 min, 95°C 30 s, 40× (95°C 10 s, 60°C 30 s)），内参基因（GAPDH或18S rRNA） 阅读提示：Materials and methods: RNA extraction and RT-qPCR |
| 活细胞成像 | 成像培养皿（35mm玻璃底），显微镜（Nikon AX或CSU-W1），物镜（60× NA 1.42），激光线（405, 488, 561, 640 nm），成像条件（温度37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Live-cell imaging |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪（CytoFLEX S），细胞处理（PBS洗, 0.05%胰酶消化），荧光通道设置 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry |
| 稳定细胞系生成和分选 | 慢病毒载体（含嘌呤霉素抗性），转导细胞系（Vero E6或HEK 293T），嘌呤霉素筛选（48h后），FACS分选（FACSAria III） 阅读提示：Materials and methods: Stable cell line generation and cell sorting |
| Western blotting | 裂解缓冲液（Beyotime），BCA定量（Beyotime），电泳系统（Bio-Rad Mini PROTEAN），转印装置（半干转），抗体（anti-sfGFP, anti-N, anti-β-actin），ECL底物 阅读提示：Materials and methods: Western blotting |
| 免疫荧光 | 固定（4% PFA, 15 min），透化（0.5% Triton X-100, 5 min），封闭（5% BSA, 1h），一抗（anti-NONO, 1:100），二抗（Alexa Fluor 647, 1:500），核染色（DAPI, 10 µg/ml, 10 min） 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence |
| CRISPR-Cas9介导的NEAT1基因破坏 | PX459质粒，sgRNA设计（CHOPCHOP），转染，嘌呤霉素筛选，有限稀释法获得单克隆，PCR筛查 阅读提示：Materials and methods: CRISPR–Cas9–mediated disruption of a NEAT1 genomic region |
| RNA-FISH | 探针（Cy3标记，Sangon Biotech），杂交条件（100 nM探针，40°C过夜），清洗步骤，核染色（DAPI） 阅读提示：Materials and methods: RNA fluorescence in situ hybridization |
| 细胞活力、凋亡和RNA稳定性检测 | CCK-8（Apexbio），细胞密度（2×10^4/孔），处理时间（1-5h），凋亡染色（Annexin V/PI），ActD浓度（3 µg/ml 或 5 µg/ml） 阅读提示：Materials and methods: Cellular viability, apoptosis, and RNA stability assays |
| 病毒产生和标记 | trVLP系统（Caco-2-N细胞），病毒收获时间（48, 96h），浓缩方法（PEG6000, NaCl），标记（SYTO Deep Red, 2 µM），脱盐柱（PD MiniTrap G-25） 阅读提示：Materials and methods: Virus production, concentration, and fluorescent labeling |
| 结构建模与对接 | AlphaFold3建模，HADDOCK 2.4对接（Molecule 1: tDeg, Molecule 2: Pepper-crRNA） 阅读提示：Materials and methods: Structural modeling and docking |
| 统计分析 | 统计软件（GraphPad Prism 10.3.1），检验方法（two-tailed unpaired Student's t-test），显著性阈值（P < 0.05） 阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis |