RNA-seq筛选E3连接酶
鉴定在HSV-1感染中可能参与先天免疫应答的E3泛素连接酶
HSV-1感染BMDMs后，通过RNA-seq分析差异表达基因，鉴定出包括Dtx2在内的上调E3连接酶，并通过RT-PCR和western blot验证Dtx2表达上调。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Deltex E3泛素连接酶2通过K63连接的泛素化增强STING介导的I型干扰素应答
Deltex E3 ubiquitin ligase 2 potentiates STING-mediated type I interferon response by K63-linked ubiquitination.
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMDMs, PMs, MEFs）、体内动物模型（HSV-1感染及肿瘤模型）及机制验证（泛素化位点、相互作用、转位等）
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs) 小鼠腹腔巨噬细胞(PMs) 小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs) MOC1小鼠头颈癌细胞系
重点核对
Dtx2基因敲除小鼠的构建及Dtx2表达缺失的确认 HSV-1感染或cGAMP/ISD刺激的剂量和时间（如4-8小时） STING泛素化位点K236和K370突变的验证 cGAMP给药方式及剂量（瘤内注射10μg） 抗PD-L1抗体给药方案（腹膜内注射200μg每只，每3天一次）
摘要
干扰素基因刺激因子(STING)信号作为一种关键的DNA传感机制，通过诱导I型干扰素应答来协调抗病毒和抗肿瘤免疫。STING信号的精确调控对于维持免疫稳态至关重要，但其调控网络尚未完全阐明。在此，我们鉴定出Deltex E3泛素连接酶2(DTX2)是STING-I型干扰素应答的正调控因子。在小鼠巨噬细胞和胚胎成纤维细胞(MEFs)中，Dtx2的缺失显著损害了双链DNA(dsDNA)或环状GMP-AMP(cGAMP)刺激诱导的I型干扰素产生。相应地，Dtx2−/−小鼠比其对照更易感染DNA病毒。机制上，DTX2与STING相互作用，促进残基K236和K370上的K63连接泛素化，这促进了STING从内质网(ER)到高尔基体的转位，并激活下游信号级联。此外，我们证明DTX2在多种肿瘤细胞系中增强STING介导的I型干扰素应答，并在小鼠头颈癌模型中增强抗肿瘤免疫。总之，我们的工作揭示了DTX2是STING的一个以前未被认识的调控因子，揭示了一种依赖泛素的微调先天免疫应答的机制，对对抗感染和癌症具有意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DTX2是否及如何调控STING介导的I型干扰素应答？
- 核心机制
- DTX2与STING结合，催化STING上K236和K370残基的K63连接泛素化，促进STING从ER到高尔基体的转位，增强TBK1招募和激活，从而增强I型干扰素应答。
- 主要证据
- 使用Dtx2敲除小鼠的BMDMs、PMs和MEFs，发现dsDNA刺激后I型干扰素应答受损；体内Dtx2−/−小鼠对HSV-1更易感；过表达DTX2增强STING泛素化和信号通路；K236R/K370R突变削弱了功能。
- 研究意义
- DTX2被鉴定为STING信号的新调控因子，为对抗病毒感染和肿瘤提供潜在的治疗靶点或生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证Dtx2缺失对I型干扰素应答的影响
验证Dtx2缺失是否损害dsDNA刺激下的I型干扰素应答
利用Dtx2−/−小鼠的BMDMs、PMs和MEFs，用HSV-1、cGAMP或ISD刺激，检测Ifnb、Ccl5、Cxcl10 mRNA水平及STING下游信号蛋白的磷酸化。
相互作用和泛素化机制解析
确定DTX2与STING的相互作用及介导的泛素化类型和位点
通过Co-IP、GST pull-down和共聚焦显微镜验证DTX2与STING的相互作用；通过泛素化实验和突变体确定K63连锁泛素化及位点K236/K370。
STING转位和TBK1招募检测
验证DTX2对STING从ER到高尔基体转位及TBK1招募的影响
通过共聚焦显微镜和亚细胞分离检测STING与高尔基体标志物共定位；通过Co-IP检测STING-TBK1相互作用；使用BFA阻断转位以验证其必要性。
体内抗病毒实验
评估Dtx2缺失对小鼠HSV-1感染的影响
WT和Dtx2−/−小鼠尾静脉注射HSV-1，监测生存率、肺病理、病毒载量及组织细胞因子表达。
肿瘤细胞系和体内抗肿瘤实验
评估DTX2在肿瘤细胞中对STING信号和抗肿瘤免疫的作用
在FaDu、MOC1和HeLa细胞中过表达DTX2，检测cGAMP或顺铂刺激后的IFN应答；建立MOC1肿瘤模型，联合cGAMP或anti-PD-L1治疗，评估肿瘤生长和免疫浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗磷酸化TBK1/NAK (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483S |
| 抗STING抗体 | Abclonal | A3575 | |
| 抗磷酸化p65抗体 | Abclonal | AP1294 | |
| 抗p65抗体 | Abclonal | A2547 | |
| 抗磷酸化TBK1抗体 | Abclonal | AP1026 | |
| 抗TBK1抗体 | Abclonal | A3458 | |
| 抗磷酸化IRF3-S396抗体 | Abclonal | AP0623 | |
| 抗IRF3抗体 | Abclonal | A2172 | |
| 抗Myc抗体 | Abclonal | AE070 | |
| 抗HA抗体 | Abclonal | AE105 | |
| 抗GM130抗体 | Abclonal | A16248 | |
| 抗Flag抗体 | Bioswamp | TAG10001 | |
| 抗STING抗体 | Proteintech | 19851-1-AP | |
| 抗TGN46抗体 | Proteintech | 13573-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Affinity Biosciences | T0022 | |
| 山羊抗兔二抗 | Affinity Biosciences | S0001 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Affinity Biosciences | S0002 | |
| 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 557659 | |
| 抗CD3抗体 | BD Biosciences | 562600 | |
| 抗CD8抗体 | BD Biosciences | 552877 | |
| 抗NK1.1抗体 | Biolegend | 156506 | |
| FITC标记的山羊抗兔IgG | ZSGB-BIO | -- | |
| 罗丹明(TRITC)标记的山羊抗小鼠IgG | ZSGB-BIO | -- | |
| 刺激物 | 2'3'-cGAMP | InvivoGen | tlrl-nacga23-02 |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ELISA | 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0033 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0044 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3063 | |
| 核浆蛋白提取 | 核浆蛋白提取试剂盒 | Glpbio | -- |
| 高尔基体分离 | 高尔基体富集试剂盒 | Invent Biotechnologies | -- |
| 免疫组化 | 三色多重荧光免疫组化试剂盒 | Absin | abs50088 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 逆转录 | cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- |
| RT-PCR | SYBR Green染料 | -- | -- |
| 罗氏LightCycler480 II实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| siRNA转染 | RNAmate转染试剂 | GenePharma | G04001 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| DMEM-F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 布雷菲德菌素A | -- | -- |
| 顺铂 | -- | -- | |
| 肿瘤模型 | 抗PD-L1抗体 | Bio X Cell | clone |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞感染与刺激 | HSV-1感染复数（MOI 10）、cGAMP和ISD刺激浓度及时间、Dtx2敲除细胞的来源 阅读提示：Methods中的Viruses and infection部分、图1图例 |
| STING泛素化位点验证 | STING K236R和K370R突变构建、Ub突变体（K6、K11等）、转染时间和剂量 阅读提示：Methods中的Ubiquitination assay、图5图例 |
| 高尔基体分离与转位检测 | 高尔基体富集试剂盒操作步骤、HSV-1感染时间、共聚焦显微镜参数 阅读提示：Methods中的Golgi apparatus isolation和Confocal microscopy部分 |
| 体内病毒感染模型 | HSV-1尾静脉注射剂量、小鼠品系和性别、感染时间点、样本量 阅读提示：Methods中的Viruses and infection部分、图6图例 |
| 肿瘤模型与治疗 | MOC1细胞接种数量、cGAMP瘤内注射剂量和频率、anti-PD-L1剂量和频率 阅读提示：Methods中的Tumor models部分、图7和8图例 |