验证POLR2A在细胞衰老中的表达下调
确定POLR2A表达与细胞衰老的相关性。
利用复制性衰老HFF1细胞（不同传代）和H2O2诱导衰老模型，通过SA-β-gal染色确认衰老，并通过Western blot检测POLR2A蛋白水平；在老龄小鼠不同组织中检测POLR2A水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
LMO7介导的POLR2A降解通过MDM4/p53/p21轴促进细胞衰老
LMO7-mediated POLR2A degradation promotes cellular senescence through the MDM4/p53/p21 axis.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型（HFF1、MRC5）、H2O2诱导和复制性衰老模型、体内小鼠模型，并进行功能验证（敲低/过表达/CRISPRa）和机制验证（Co-IP、泛素化、RNA-seq）。
主要模型
HFF1人皮肤成纤维细胞 MRC5人肺成纤维细胞 C57BL/6小鼠
重点核对
POLR2A在衰老细胞和小鼠组织中的表达下调 POLR2A敲低诱导衰老及p53/p21通路激活 POLR2A敲低通过抑制MDM4转录稳定p53 LMO7介导POLR2A泛素化降解 CRISPRa激活POLR2A表达挽救衰老表型
摘要
作为RNA聚合酶II的最大亚基，POLR2A在基因表达中发挥不可替代的作用，其自身表达和生理功能的调控已引起广泛关注。在这里，我们报道POLR2A是细胞衰老的关键守护者。在衰老细胞和衰老小鼠的某些组织中观察到POLR2A表达显著下降。而其耗竭强烈诱导细胞衰老，相反，使用CRISPRa技术在衰老细胞中激活内源性POLR2A表达则减轻了衰老表型。我们进一步证明POLR2A诱导的衰老是p53依赖性的，这通过POLR2A敲低时p53/p21通路的激活以及POLR2A和p53共耗竭后衰老表型的挽救得以证实。对POLR2A耗竭和复制性衰老细胞的RNA-seq数据进行生物信息学分析，鉴定出MDM4是POLR2A敲低后p53上调的关键介质。最有趣的是，免疫沉淀实验进一步揭示E3连接酶LMO7被招募到POLR2A，在细胞衰老过程中促进POLR2A的泛素化和蛋白酶体降解。在H2O2诱导的衰老细胞中，LMO7的耗竭消除了POLR2A的泛素化和减少。综上所述，我们得出结论，LMO7诱导的POLR2A降解通过MDM4/p53/p21轴驱动细胞衰老。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- POLR2A在细胞衰老中的具体作用和机制尚不清楚，本研究旨在阐明其调控衰老的分子机制。
- 核心机制
- LMO7介导POLR2A的泛素化和蛋白酶体降解，导致POLR2A下调，进而抑制MDM4的转录，解除对p53的抑制，激活p53/p21通路，最终诱导细胞衰老。
- 主要证据
- 在复制性衰老和H2O2诱导的衰老细胞以及老龄小鼠组织中POLR2A蛋白水平下调；POLR2A敲低激活p53/p21并诱导衰老，共敲低p53挽救表型；POLR2A敲低降低MDM4表达和p53泛素化；LMO7敲低抑制POLR2A泛素化；CRISPRa激活POLR2A减轻衰老。
- 研究意义
- 本研究揭示了一个新的LMO7/POLR2A/MDM4/p53/p21轴作为细胞衰老的关键调节因子，为衰老相关疾病提供了潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
POLR2A敲低诱导细胞衰老的表型及p53/p21通路验证
验证POLR2A缺失是否诱导细胞衰老，并初步探索其机制。
在HFF1和MRC5细胞中敲低POLR2A，检测SA-β-gal阳性率、细胞增殖（EdU掺入）、生长曲线、SASP因子（IL-6、IL-8）水平，以及p53和p21蛋白水平。
验证POLR2A敲低通过p53依赖途径诱导衰老
确认POLR2A诱导的衰老是否依赖于p53。
在POLR2A敲低同时敲低p53，检测SA-β-gal阳性率、EdU掺入和p21蛋白水平，与单独POLR2A敲低比较。
探究POLR2A敲低稳定p53的机制
明确POLR2A敲低如何导致p53蛋白水平升高。
检测p53 mRNA水平，进行CHX追踪实验检测p53蛋白稳定性，通过Co-IP检测p53泛素化水平，利用RNA-seq和UbiBrowser预测寻找关键E3连接酶，验证MDM4和BMI1敲低的影响，检测MDM4表达和p53结合。
探究衰老过程中POLR2A下调的机制
确定POLR2A蛋白在衰老细胞中降低的分子机制。
检测POLR2A mRNA水平，使用MG132和MLN4924处理验证蛋白酶体和泛素化依赖性，通过Co-IP检测POLR2A泛素化，进行MS筛选与POLR2A互作的蛋白，验证LMO7和TRIM21的作用，并检测LMO7敲低对POLR2A水平和泛素化的影响。
激活内源性POLR2A表达对细胞衰老的影响
验证恢复POLR2A表达能否逆转细胞衰老。
使用CRISPRa技术激活HFF1细胞中内源性POLR2A表达，在H2O2诱导和复制性衰老模型中检测SA-β-gal、EdU掺入和衰老相关蛋白的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测蛋白和基因表达
基因编辑操作
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| MEM培养基 | 文中未明确说明 | -- | |
| 胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| siRNA敲低 | siRNA | RiboBio | -- |
| 药物处理 | MG132蛋白酶体抑制剂 | -- | 133407-82-6 |
| MLN4924（NEDD8活化酶抑制剂） | -- | 905579-51-3 | |
| 蛋白质检测 | Protein G- PLUS琼脂糖珠 | Thermo Fisher | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 质谱分析 | 银染试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Sigma | -- |
| RT-PCR | 脱氧核糖核酸酶I | Promega | -- |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | -- | |
| SA-β-gal染色 | SA-β-gal染色试剂盒 | Beyotime | -- |
| EdU染色 | EdU染色试剂盒 | MeilunBio | -- |
| 显微镜观察 | Ti-S显微镜 | Nikon | -- |
| DMI8显微镜 | Leica | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 质粒构建 | pMSCV-LTR-dCas9-VP64-BFP载体 | -- | 46912 |
| pSLQ1651-sgTelomere (F+E)载体 | -- | 51024 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、血清浓度、培养条件 阅读提示：见Methods中的Cell culture部分 |
| siRNA敲低 | siRNA序列、转染试剂、转染剂量、细胞密度、检测时间点 阅读提示：见Methods中的siRNA knockdown部分和补充表S1 |
| H2O2处理诱导衰老 | H2O2浓度、处理时间、恢复时间 阅读提示：见Methods中的Inhibitor and H2O2 treatment部分 |
| CHX处理 | CHX浓度、处理时间点 阅读提示：见Methods中的Inhibitor and H2O2 treatment部分 |
| MG132处理 | MG132浓度、处理时间点 阅读提示：见Methods中的Inhibitor and H2O2 treatment部分 |
| MLN4924处理 | MLN4924浓度、处理时间点 阅读提示：见Methods中的Inhibitor and H2O2 treatment部分 |
| CRISPRa激活 | 载体构建、病毒包装、感染和筛选条件 阅读提示：见Methods中的Plasmid construction和CRISPR/dCas9-mediated gene activation部分 |
| Co-IP | 裂解缓冲液、抗体、磁珠、洗涤条件 阅读提示：见Methods中的Co-immunoprecipitation部分 |
| RNA-seq | 文库构建、测序平台、分析流程 阅读提示：见Methods中的RNA-seq部分 |
| SA-β-gal染色 | 染色试剂盒、固定和染色步骤 阅读提示：见Methods中的SA-β-gal and EdU staining部分 |
| EdU染色 | EdU试剂盒、标记和检测步骤 阅读提示：见Methods中的SA-β-gal and EdU staining部分 |
| RT-PCR | RNA提取、反转录、引物、PCR循环 阅读提示：见Methods中的RT-PCR部分 |
| ELISA | 试剂盒、样本收集、检测步骤 阅读提示：见Methods中的ELISA部分 |