氧化应激诱导mtDNA释放及cGAS-STING激活
验证在角质形成细胞中，H2O2诱导的氧化应激是否导致线粒体DNA释放并激活cGAS-STING通路。
使用500 μM H2O2处理HaCaT细胞和NHKs 24小时，通过免疫荧光和亚细胞分级检测胞质mtDNA，并通过Western blot和RT-qPCR检测cGAS/STING通路和下游趋化因子。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
角质形成细胞中线粒体DNA经VDAC1释放：先天免疫和白癜风发病机制的关键驱动因素
Mitochondrial DNA release via VDAC1 in keratinocytes: a key driver of innate immunity and vitiligo pathogenesis.
实验完整度
高包括体外细胞模型（HaCaT、NHK）、动物模型（小鼠）、临床患者样本，以及功能验证（siRNA敲低、药物抑制）、机制验证（mPTP、VDAC1寡聚化）和体内验证。
主要模型
HaCaT细胞 正常人角质形成细胞（NHKs） H2O2诱导的白癜风小鼠模型 白癜风患者皮损周围皮肤
重点核对
H2O2浓度和刺激时间（500 μM，24小时） VBIT-4处理剂量和途径（10 mg/kg，皮内注射，每日一次，持续3周） siRNA敲低VDAC1的效率（约50%） EtBr预处理浓度和时间（0.2 μg/mL，48小时） mtDNA转染剂量（1 μg/mL）
摘要
白癜风是一种自身免疫性色素脱失性疾病，氧化应激被认为是先天免疫激活的关键触发因素。尽管角质形成细胞日益被认为在疾病进展中起关键作用，但其感知和传播氧化应激信号的机制仍不清楚。在此，我们确定线粒体DNA（mtDNA）释放是将氧化应激与角质形成细胞免疫激活联系起来的关键事件。我们证明过氧化氢诱导顺序性线粒体膜重塑过程，其中线粒体通透性转换孔开放先于外膜通道蛋白VDAC1的寡聚化，从而在非凋亡条件下选择性释放mtDNA。逃逸的mtDNA作为危险信号，同时激活cGAS-STING轴和NLRP3炎症小体，驱动I型和II型干扰素产生、趋化因子释放和细胞焦亡。重要的是，基因沉默或使用VBIT-4药理学抑制VDAC1有效阻断mtDNA释放，抑制下游炎症级联反应，并减轻小鼠白癜风模型中的脱色和CD8⁺T细胞浸润。这些发现揭示了角质形成细胞将氧化应激转化为自身免疫信号的一种先前未被认识的机制，并强调VDAC1依赖性mtDNA释放是早期干预白癜风的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 氧化应激如何通过角质形成细胞中的线粒体DNA释放触发先天免疫，从而促进白癜风发病？
- 核心机制
- 角质形成细胞在氧化应激下，线粒体通透性转换孔（mPTP）开放先于VDAC1寡聚化，导致mtDNA释放；释放的mtDNA同时激活cGAS-STING轴和NLRP3炎症小体，驱动I型和II型干扰素及趋化因子产生，并诱导细胞焦亡。
- 主要证据
- H2O2处理HaCaT细胞和NHKs诱导mtDNA释放并激活cGAS-STING通路；mtDNA转染直接激活cGAS-STING-NLRP3轴并诱导焦亡；CsA和VBIT-4抑制mtDNA释放；VBIT-4减轻小鼠模型脱色和CD8+T细胞浸润。
- 研究意义
- 揭示角质形成细胞将氧化应激转化为自身免疫信号的新机制，并提示VDAC1依赖性mtDNA释放作为早期干预白癜风的有前景的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
mtDNA耗竭对免疫反应的影响
确定胞质mtDNA是否必要用于H2O2诱导的免疫反应。
用EtBr预处理细胞以减少mtDNA，然后H2O2刺激，检测cGAS-STING通路和NLRP3炎症小体的激活以及炎症因子表达。
mtDNA转染验证其免疫原性
检验外源性mtDNA是否能直接激活角质形成细胞中的免疫反应和焦亡。
从HaCaT细胞分离纯化mtDNA，转染至角质形成细胞，检测cGAS-STING-NLRP3轴激活、干扰素和趋化因子表达、以及焦亡特征（PI染色、LDH释放）。
cGAS抑制剂验证通路依赖性
验证H2O2诱导的免疫反应是否经由cGAS-STING通路。
使用RU.521预处理细胞，然后H2O2刺激，检测cGAS-STING通路和NLRP3炎症小体激活及下游趋化因子表达。
阐明mtDNA释放的机制
确定mPTP开放和VDAC1寡聚化在mtDNA释放中的顺序和必要性。
使用CsA（mPTP抑制剂）和VBIT-4（VDAC1寡聚化抑制剂）预处理，检测mPTP开放、VDAC1寡聚化、线粒体膜间质及胞质mtDNA水平。
遗传沉默VDAC1验证其作用
通过基因敲低确认VDAC1在mtDNA释放和免疫反应中的作用。
在NHKs中使用siRNA沉默Vdac1，然后用H2O2处理，检测胞质mtDNA水平和趋化因子表达。
体内验证VBIT-4的治疗效果
在动物模型中评估VDAC1抑制对白癜风样病变和免疫浸润的影响。
建立H2O2诱导的白癜风小鼠模型，皮内注射VBIT-4，检测色素沉着、黑色素细胞密度、CD8+T细胞浸润和cGAS-STING通路蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 角质形成细胞无血清培养基 | ThermoFisher | 17005042 | |
| 氧化应激诱导 | 过氧化氢 | Yonghua Chemical | 21040210 |
| 线粒体DNA耗竭 | 溴化乙锭 | MedChemExpress | HY-D0021 |
| cGAS抑制 | RU.521 | MedChemExpress | HY-114180 |
| mPTP抑制 | 环孢素A | Macklin | C804822 |
| VDAC1抑制 | VBIT-4 | Aladdin | V413014 |
| 细胞活性检测 | MTT试剂 | Beyotime | C0009S |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI试剂盒 | Beyotime | C1062S |
| 焦亡检测 | Calcein-AM/PI染色试剂 | Beyotime | C2015S |
| 细胞毒性检测 | LDH释放检测试剂盒 | Beyotime | C0019S |
| mPTP检测 | mPTP检测试剂盒 | Beyotime | C2009S |
| 线粒体标记 | MitoTracker Red CMXRos线粒体染料 | ThermoFisher | M7512 |
| dsDNA染色 | PicoGreen dsDNA染料 | ThermoFisher | P7589 |
| DNA提取 | FastPure细胞/组织DNA提取试剂盒 | Vazyme | DC102-01 |
| 蛋白降解 | 蛋白酶K | Beyotime | ST533 |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | Beyotime | C3601 |
| mtDNA转染 | Lipofectamine转染试剂 | Yeasen | 40802ES01 |
| 免疫荧光 | 抗VDAC1抗体 | Abcam | ab154856 |
| 抗TRP-1抗体 | Abcam | ab178676 | |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab316778 | |
| 抗CXCL9抗体 | Abcam | ab290643 | |
| 抗CXCL10抗体 | Abcam | ab318282 | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Vazyme | R401-01 |
| 反转录 | HiScript IV RT SuperMix反转录试剂 | Vazyme | R423-01 |
| 实时定量PCR | ChamQ Blue Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q312-02 |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 组织蛋白提取 | 组织总蛋白提取试剂盒 | Applygen | P1250 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0011 |
| Western blot | 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab283819 |
| 抗Caspase-1抗体 | Abcam | ab207802 | |
| 抗人cGAS抗体 | Santa Cruz | sc-515777 | |
| 抗小鼠cGAS抗体 | Abcam | ab252416 | |
| 抗人STING抗体 | Abcam | ab239074 | |
| 抗小鼠STING抗体 | Abcam | ab288157 | |
| 抗磷酸化NF-κB抗体 | Abcam | ab76302 | |
| 抗NF-κB抗体 | Santa Cruz | sc-8008 | |
| 抗GSDMD抗体 | MedChemExpress | HY-P83706 | |
| 抗CXCL16抗体 | Abcam | ab307694 | |
| 抗人CXCL9抗体 | Abcam | ab290643 | |
| 抗小鼠CXCL9抗体 | Abcam | ab320827 | |
| 抗人CXCL10抗体 | Abcam | ab318282 | |
| 抗小鼠CXCL10抗体 | Santa Cruz | sc-374092 | |
| 抗IFN-γ抗体 | Abcam | ab267369 | |
| 抗VDAC1抗体 | Abcam | ab186321 | |
| 抗β-actin抗体 | ABclonal | AF0003 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Beyotime | A0208 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0216 | |
| ECL化学发光试剂盒 | -- | -- | |
| 交联实验 | 乙二醇双（琥珀酰亚胺琥珀酸酯） | Aladdin | E59534 |
| ELISA | 人CXCL9 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H6062 |
| 人CXCL10 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0050 | |
| siRNA转染 | VDAC1 siRNA | Santa Cruz | sc-42355 |
| siRNA转染试剂 | Santa Cruz | sc-29528 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HaCaT细胞培养条件（DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素）；NHKs培养条件（Keratinocyte-SFM）；H2O2浓度（500 μM）和处理时间（24小时）；EtBr浓度（0.2 μg/mL）和处理时间（48小时）；VBIT-4浓度（1-10 μM）和预处理时间（1小时）；RU.521浓度（10 μM）和预处理时间（1小时） 阅读提示：Methods: Cell culture and treatment |
| 动物模型 | 小鼠品系（雌性C57BL/6，5周龄，20±2g）；分组（PBS对照，H2O2模型，H2O2+VBIT-4组）；每组6只；5% H2O2局部涂抹，每日两次，持续4周；VBIT-4剂量10 mg/kg，皮内注射，每日一次，持续3周；VBIT-4溶剂（10% DMSO+90%盐水含20% SBE-β-CD） 阅读提示：Methods: Animal models |
| mtDNA释放检测 | 细胞密度（约6×10^6）；digitonin浓度（25 μg/mL）；蛋白酶K浓度（20 μg/mL）；mtDNA定量用引物（ATP6等，见补充表S1）；RT-qPCR内参基因GAPDH 阅读提示：Methods: Cellular fractionation and quantification of cytosolic mtDNA with qPCR; Supplementary Table S1 |
| mtDNA转染 | mtDNA分离方法（两步法）；转染试剂Lipofectamine 1:1比例（μg DNA:μL试剂）；转染密度（5×10^5细胞/孔）；mtDNA剂量（1 μg/mL）；转染时长（1-6小时） 阅读提示：Methods: mtDNA isolation and transfection |
| 统计学评估 | 至少三次独立实验；Shapiro-Wilk检验；Brown-Forsythe检验；两组比较用双尾非配对t检验；多组比较用单因素方差分析和Tukey事后检验；显著性水平p<0.05 阅读提示：Methods: Statistical analysis |