Ccdc117 deficiency triggers hyperandrogenemia, maintaining normal sperm production despite reduced testis size
包含CRISPR/Cas9基因敲除小鼠模型、转录组分析（RNA-seq）、蛋白表达验证（Western blot）、免疫荧光定位、血清及睾丸内激素水平检测（ELISA）、精子参数分析及连续交配生育力测试等多个独立证据层级，并有明确功能验证和机制探究。
Ccdc117敲除小鼠（C57BL/6J背景） 野生型小鼠（C57BL/6J背景） 小鼠睾丸组织 人类睾丸组织
Ccdc117基因敲除：CRISPR/Cas9技术，gRNA靶序列5'-CCTTTCTGACACCATGAAAACGG-3'，造成外显子4中46-bp移码缺失 小鼠遗传背景：C57BL/6J，SPF级动物房，温度22±2°C，12小时光照/12小时黑暗循环 血清激素检测：ELISA试剂盒（Elabscience），样本重复两次，批内和批间变异系数<10% 生育力评估：8周龄雄性小鼠与8-10周龄雌性小鼠连续交配10个月，记录产仔数和窝产仔数 睾丸组织学：4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，HE染色，深度学习算法进行细胞计数
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CCDC117在进化上的保守性及其在睾丸中的表达特征，以推测其潜在的生理功能。
通过系统发育分析比较CCDC117直系同源物，并与其他CCDC家族成员进行聚类分析；使用qPCR和Western blot检测成年野生型小鼠多组织中Ccdc117 mRNA和蛋白表达；通过Western blot检测出生后发育过程中（P3-P21）CCDC117蛋白水平变化；通过免疫荧光检测小鼠和人睾丸组织中CCDC117的定位。
确定CCDC117缺失对睾丸发育、精子参数和生育力的影响。
使用CRISPR/Cas9技术构建Ccdc117敲除小鼠，通过Western blot确认蛋白缺失；测量体重、体长、睾丸重量及睾丸/体重比；分析附睾精子浓度、活力、形态；进行组织学检查并计数各种生精细胞数量；通过连续交配试验评估生育力。
验证Ccdc117缺失时生精过程是否完整以及生育力是否受影响。
通过HE染色观察生精上皮各阶段（I-XII）的形态；计数每个小管的生精细胞数量；通过免疫荧光检测PLZF（精原干细胞标志物）和γH2AX（减数分裂标志）的表达；通过Western blot检测DAZL、STRA8、SYCP3等蛋白水平；通过10个月连续交配实验评估生育力。
阐明Ccdc117缺失导致睾丸减小但精子发生保持的分子机制。
对WT和KO睾丸进行RNA-seq，鉴定差异表达基因并富集分析；通过Western blot和免疫荧光验证类固醇生成酶（CYP17A1、HSD3B2、StAR）的表达和定位；通过ELISA检测血清和睾丸内睾酮、LH、FSH、GnRH水平；通过HE染色计数Leydig细胞数量；通过RT-qPCR验证细胞杀伤通路相关基因表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | CRISPR/Cas9基因组编辑 | Cyagen Biosciences Inc. | -- |
| 基因型鉴定 | 聚合酶链反应 | -- | -- |
| 精子分析 | Hamilton Thorne IVOS 计算机辅助精子分析系统 | Hamilton Thorne | -- |
| 人输卵管液培养基 | Nanjing Ibe Biotechnology Co., Ltd. | M1135 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| PVDF膜 | Thermo Scientific | 88518 | |
| 增强化学发光试剂 | Beyotime | P0018S | |
| 抗CCDC117抗体 | Invitrogen | PA5-51461 | |
| 抗PLZF抗体 | Santa Cruz | sc-28319 | |
| 抗DAZL抗体 | AbD Serotec | MCA2336 | |
| 抗SYCP3抗体 | Abcam | ab314751 | |
| 抗HSD3B2抗体 | Thermo | PA5-106895 | |
| 抗CYP17A1抗体 | Abclonal | A1373 | |
| 抗STAR抗体 | Proteintech | 12225-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Abclonal | AC026 | |
| 免疫荧光 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| 人睾丸组织切片 | Zhenjiang Biosc Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| RNA-seq | Illumina Truseq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8 | GraphPad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建与饲养 | Ccdc117基因敲除小鼠的构建方法（CRISPR/Cas9，gRNA序列），遗传背景（C57BL/6J），饲养环境（SPF级，温度22±2°C，12小时光照/黑暗循环），伦理审批号（南京医科大学动物伦理与福利委员会 No. IACUC-2406117） 阅读提示：Materials and methods: Animals |
| 精子参数分析 | 附睾精子采集方法（双侧附睾尾，在1 ml预温人输卵管液中剪碎，37°C孵育30分钟），精子浓度测定（血细胞计数器），活力评估（Hamilton Thorne IVOS系统） 阅读提示：Materials and methods: Sperm count and sperm motility |
| 组织学分析 | 固定方法（4%多聚甲醛24小时，睾丸再固定24小时），石蜡包埋切片厚度（5μm），HE染色，细胞计数使用深度学习算法并分析每只小鼠3个不连续切片 阅读提示：Materials and methods: Histology and cell counting; Results: Ccdc117-deficient mice maintain intact... Figure 3 |
| 激素水平检测 | 血清采集方法（眶后窦穿刺，凝固30-60分钟，离心2000xg 10分钟），睾丸内激素提取（匀浆，离心12,000xg 20分钟），ELISA试剂盒（Elabscience），样本重复数和变异系数（<10%） 阅读提示：Materials and methods: Enzyme-linked immunosorbent assay; Results: Loss of Ccdc117 triggers... Figure 4G and 4I |
| 生育力评估 | 交配试验开始年龄（8周），雌鼠年龄（8-10周），交配周期（10个月），雌鼠更换时机（6个月龄时更换为年轻雌鼠），记录指标（产仔数和窝产仔数） 阅读提示：Materials and methods: Fertility assessment; Results: Ccdc117-deficient mice maintain intact... Figure 3G |
