OVX小鼠模型建立及表型分析
验证雌激素缺乏诱导骨质疏松并评估SIRT5及铜死亡相关标志物变化
对C57BL/6小鼠进行卵巢切除或假手术，8周后通过micro-CT检测骨参数，测量血清和骨组织铜水平，并通过qPCR、Western blot和免疫荧光检测SIRT5、FDX1、CTR1、ATP7A等表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SIRT5通过FDX1去丙二酰化及抑制间充质干细胞铜死亡介导雌激素的促成骨作用
SIRT5 mediates the pro-osteogenic effects of estrogen through FDX1 demalonylation and cuproptosis inhibition in mesenchymal stem cells.
实验完整度
高包含体内OVX小鼠模型、细胞模型（C3H10T1/2）、功能验证（成骨分化、ALP/茜素红）、机制验证（Co-IP、点突变、蛋白降解途径）等多层级实验，证据链完整。
主要模型
去卵巢（OVX）小鼠模型 C3H10T1/2小鼠间充质干细胞 HEK293细胞
重点核对
OVX小鼠分组及处理（Sham、OVX、OVX+高铜饮食、OVX+TTM、OVX+MC3138） SIRT5激活剂MC3138剂量（150 mg/kg/day，腹腔注射，8周） TTM剂量（10 mg/kg，每周三次，腹腔注射，8周） Elesclomol浓度（15 nM）处理C3H10T1/2细胞 雌二醇浓度（5 μM）处理C3H10T1/2细胞
摘要
骨质疏松症是一种常见的骨科疾病，主要由绝经后女性雌激素缺乏引起，由于其分子机制尚不明确，持续构成重大的公共卫生挑战。虽然铜死亡已被牵涉到多种病理状态，但其在骨质疏松症发病机制中的具体作用仍不清楚。Sirtuin 5（SIRT5）是一种线粒体脱酰基酶，在衰老和骨形成中的作用已被充分表征，但其在雌激素缺乏相关骨质疏松症中的功能作用同样不明确。在本研究中，我们确定了一个新的潜在雌激素/SIRT5/铁氧还蛋白1调控轴，其调节铜死亡和间充质干细胞的谱系定向。使用去卵巢小鼠模型，我们观察到血清铜水平降低，而骨组织中铜积累升高。雌激素缺乏下调SIRT5表达，促进铜死亡，并诱导明显的骨丢失。铜死亡直接损害间充质干细胞的成骨分化，而SIRT5过表达部分挽救了这一谱系定向缺陷。机制上，我们表明雌激素上调SIRT5表达，进而介导铁氧还蛋白1的脱丙二酰化并增强其溶酶体降解。这种双重调控机制可能有效抑制铜死亡并恢复间充质干细胞的成骨潜能。我们的发现提示，新型雌激素/SIRT5/FDX1轴可能作为骨稳态的关键调节因子，并确定SIRT5作为绝经后骨质疏松症的潜在治疗候选靶点，可能通过其降低间充质干细胞铜死亡样特征的能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 雌激素缺乏相关骨质疏松症中，SIRT5和铜死亡的作用机制及相互联系如何？
- 核心机制
- 雌激素上调SIRT5，SIRT5介导FDX1脱丙二酰化并增强其溶酶体降解，从而抑制铜死亡并恢复间充质干细胞的成骨分化潜能。
- 主要证据
- OVX小鼠中SIRT5下调、FDX1上调，铜死亡标志物变化；SIRT5过表达部分逆转elesclomol诱导的成骨抑制和铜死亡；Co-IP和点突变证明FDX1 K162脱丙二酰化；BafA1而非MG132阻断雌激素诱导的FDX1降解。
- 研究意义
- 揭示了雌激素/SIRT5/FDX1轴作为骨稳态关键调节因子的新机制，提示SIRT5可能成为绝经后骨质疏松症的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证铜死亡和SIRT5在骨质疏松中的作用
验证高铜、铜螯合剂TTM和SIRT5激活剂MC3138对OVX小鼠骨丢失的影响
OVX小鼠分别给予高铜饮食、TTM（铜螯合剂）或MC3138（SIRT5激活剂），通过micro-CT、HE、Masson染色、免疫组化及Western blot评估骨量和铜死亡标志物。
体外验证SIRT5在雌激素促进成骨分化中的作用
探索SIRT5是否介导雌激素对C3H10T1/2细胞成骨分化的促进效应
用雌激素（雌二醇）、SIRT5过表达腺病毒（AdSirt5）、Sirt5敲低腺病毒（AdsiSirt5）及雌激素受体拮抗剂他莫昔芬处理细胞，检测RUNX2蛋白、ALP活性和矿化水平。
体外验证铜死亡抑制剂和诱导剂对成骨分化的影响
验证铜死亡对C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用
用elesclomol（铜死亡诱导剂）、CuCl2、TTM处理细胞，检测RUNX2、OPN蛋白、ALP活性和矿化水平。
验证SIRT5对elesclomol诱导的铜死亡和成骨抑制的缓解作用
探究SIRT5是否通过抑制铜死亡减轻elesclomol对成骨分化的损害
用elesclomol和/或AdSirt5处理细胞，检测成骨标志物、线粒体形态（TEM、Mito-tracker）、线粒体膜电位（JC-1）、铜水平及铜死亡标志物（FDX1、CTR1等）。
验证FDX1在SIRT5缓解铜死亡和成骨抑制中的作用
验证FDX1是否为SIRT5下游关键靶点，过表达FDX1能否逆转SIRT5的保护作用
在elesclomol处理下，联合AdSirt5和AdFDX1，检测成骨分化指标、线粒体功能（JC-1、Mito-tracker、TEM）、铜死亡标志物表达。
验证SIRT5和雌激素对FDX1丙二酰化修饰及蛋白稳定性的调控
阐明SIRT5是否通过去丙二酰化FDX1增强其溶酶体降解
Co-IP检测FDX1丙二酰化水平，点突变确定关键赖氨酸位点，用CHX、MG132、BafA1处理细胞检测FDX1蛋白稳定性，并用免疫荧光观察FDX1与溶酶体共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 体外药物处理 | 埃斯科莫尔 | MCE | HY-12040 |
| MC3138 | MCE | HY-160818 | |
| 蛋白降解抑制实验 | 巴佛洛霉素A1 | MCE | HY-100558 |
| MG132 | MCE | HY-13259 | |
| 体外药物处理 | 四硫钼酸盐 | MACKLIN | A828261 |
| 他莫昔芬 | Yuanye Biotechnology | S48264 | |
| 雌二醇 | Yuanye Biotechnology | S30633 | |
| 重组病毒构建 | Sirt5重组腺病毒 | Obio Technology | -- |
| Sirt5腺相关病毒 | Obio Technology | -- | |
| Fdx1重组腺病毒 | Obio Technology | -- | |
| Western blot | β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC026 |
| RUNX2抗体 | ABclonal | A2581 | |
| FDX1抗体 | ABclonal | A20895 | |
| SIRT5抗体 | Proteintech | 5122-1-AP | |
| 泛素抗体 | Proteintech | 10201-2-AP | |
| 免疫沉淀 | 丙二酰赖氨酸抗体 | PTM Biolabs | PTM-901 |
| 乙酰赖氨酸抗体 | Abcam | ab80178 | |
| Western blot | ATP7A抗体 | Abmart | TD8506 |
| CTR1抗体 | Abmart | T510261F | |
| OPN抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10593 | |
| RNA提取 | RNA快速纯化试剂盒 | ES Science | RN001 |
| RT-qPCR | 2 × SYBR Green qPCR预混液 | Saimike | SMK-Q002 |
| Bio-Rad CFX仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶（10%） | Epizyme Biotech | PG112 |
| SDS-PAGE凝胶（12.5%） | Epizyme Biotech | PG113 | |
| PVDF膜 | Merck | PR05509 | |
| 无蛋白快速封闭液 | Epizyme Biotech | PS108P | |
| HRP标记山羊抗兔I | Beyotime | P0948 | |
| HRP标记山羊抗小鼠 | Beyotime | P0946 | |
| 化学发光检测试剂盒 | Saimike Biotech | 160072 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS +系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光染色 | 牛血清白蛋白溶液 | Solarbio | A8010 |
| 594山羊抗兔 | UElandy | Y6107S | |
| 488山羊抗小鼠 | UElandy | Y6104S | |
| PBS缓冲液 | Servicebio | G4202-100 ML | |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| 免疫荧光成像 | 徕卡TCS SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 免疫沉淀 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake | B15001 |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Bimake | B15001 | |
| Protein A/G磁珠 | Beyotime | P2108 | |
| RIPA裂解液 | Saimike | QS0006 | |
| ALP染色 | ALP试剂盒 | Beyotime | C3206 |
| 奥林巴斯IX53显微镜 | Olympus | -- | |
| 矿化测定 | 茜素红S | Sigma-Aldrich | A5533-25G |
| micro-CT | 布鲁克SKYSCAN 1276 | Bruker | -- |
| 细胞免疫荧光 | QuickBlock封闭液 | Beyotime | -- |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠 | Servicebio | GB25301 | |
| Alexa Fluor 594标记山羊抗兔 | Servicebio | GB28301 | |
| 细胞免疫荧光成像 | 徕卡TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 线粒体染色 | Mito-Tracker Red | Beyotime | C1032 |
| TEM样品制备 | 胰蛋白酶 | Saimike | SMK0104 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyotime | C2006 |
| 溶酶体染色 | 二甲基亚砜 | Saimike | SB0061 |
| LysoTracker Red | -- | -- | |
| 铜含量检测 | 铜比色法检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K300-M |
| 多功能酶标仪（ReadMax 1500） | Flash spectrum Biological Technology | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.5.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OVX模型构建 | 小鼠品系、年龄、体重、分组、手术方式、术后处理时间 阅读提示：Materials and methods: Mouse OVX model establishment and histochemical analysis |
| 药物处理 | MC3138剂量、给药方式、频率、持续时间；TTM剂量、给药方式、频率；高铜饮食配方及持续时间 阅读提示：Materials and methods: Mouse OVX model establishment and histochemical analysis |
| 细胞培养与处理 | C3H10T1/2细胞来源、培养条件、雌激素浓度、elesclomol浓度、CuCl2浓度、TTM浓度、他莫昔芬浓度、AdSirt5/AdsiSirt5/AdFDX1使用 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents; Figure legends 3-6 |
| 免疫沉淀与修饰检测 | 抗体（FDX1、malonyllysine、acetyllysine、ubiquitin、SIRT5）、磁珠类型、裂解液配方、洗脱方式 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation assay |
| 蛋白稳定性实验 | CHX浓度、MG132浓度、BafA1浓度、处理时间 阅读提示：Results 及 Figure 7 legend |