菌株培养与准备
获得用于动物实验的副干酪乳杆菌36菌悬液。
将副干酪乳杆菌36在MRS肉汤培养基中37℃培养至对数生长期，离心（5000 rpm, 5 min），弃上清，用无菌PBS洗涤三次并重悬，根据OD600标准曲线调整浓度。
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副干酪乳杆菌36通过调节肠道微生物群抑制TLR4/NF-κB/MAPK通路和NLRP3炎症小体活化，减轻小鼠D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤
Lacticaseibacillus paracasei 36 attenuates D-GalN/LPS-induced acute liver injury in mice via suppressing the TLR4/NF-κB/MAPK pathway and NLRP3 inflammasome activation through modulating the intestinal microbiota.
实验完整度
高包含动物模型、FMT实验、细胞实验、多组学（16S rRNA、转录组、代谢组）等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
C57BL/6小鼠D-GalN/LPS诱导急性肝损伤模型 抗生素清除小鼠模型 粪菌移植（FMT）小鼠模型 AML12小鼠肝细胞
重点核对
L. paracasei 36灌胃剂量：1×10^9 CFU/mL，200 μL/天，持续3周 D-GalN/LPS造模剂量：600 mg/kg D-GalN和30 μg/kg LPS腹腔注射 抗生素混合物组成：氨苄青霉素1 g/L、新霉素1 g/L、甲硝唑1 g/L、万古霉素0.5 g/L、氟康唑20 mg/L FMT实验：每日灌胃200 μL新鲜粪便悬液，持续14天 TLR4抑制剂TAK242处理AML12细胞
摘要
引言：急性肝损伤（ALI）是一种死亡率很高的严重临床综合征，常由毒素、病毒或免疫介导的损伤触发。肠肝轴是肝脏疾病进展中的关键介质，益生菌因其调节肠道微生物群、减轻炎症和缓解氧化应激的作用而被认为是可行的治疗选择。目的：本研究旨在阐明副干酪乳杆菌36对D-GalN/LPS诱导的小鼠ALI的肝脏保护机制，特别关注其在炎症、氧化应激、凋亡和肠道微生物群调节中的作用。方法：在D-GalN/LPS刺激前，用副干酪乳杆菌36预处理小鼠三周。检测血清生物标志物、氧化损伤指标、炎症细胞因子和凋亡相关基因。通过16S rRNA测序分析肠道微生物群组成，并进行肝脏转录组学和代谢组学以确定关键通路和代谢物。结果：副干酪乳杆菌36预处理显著降低血清AST、ALT和TBil水平，减轻组织病理学损伤，并减少氧化应激和炎症细胞因子的产生。它通过调节Bcl-2/Bax表达抑制肝细胞凋亡，并抑制NLRP3炎症小体活化。副干酪乳杆菌36恢复肠道微生物群平衡，增加有益菌属（Ligilactobacillus、Akkermansia）并减少有害菌属（Alistipes、Parasutterella）。多组学分析显示NF-κB/MAPK通路受到抑制，同时肝保护代谢物如小檗碱和黄素核苷酸增加。结论：副干酪乳杆菌36通过减轻炎症、氧化损伤和凋亡，以及恢复肠道微生物群稳态，对D-GalN/LPS诱导的ALI发挥有效的肝脏保护作用。总之，这些结果表明副干酪乳杆菌36代表了ALI的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 副干酪乳杆菌36对D-GalN/LPS诱导的小鼠急性肝损伤是否具有保护作用，其潜在机制是否涉及肠道菌群调节、炎症抑制和氧化应激缓解？
- 核心机制
- 副干酪乳杆菌36通过调节肠道微生物群，激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路增强抗氧化能力，抑制TLR4介导的NF-κB/MAPK信号通路和NLRP3炎症小体活化，从而减轻炎症和氧化应激。
- 主要证据
- 动物实验显示LP36预处理降低血清AST、ALT、TBil水平，减轻肝组织病理损伤，抑制炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α）产生，调节凋亡基因Bcl-2/Bax表达；FMT实验证实LP36调节的肠道菌群可转移保护效应；转录组和代谢组分析揭示NF-κB/MAPK通路抑制和有益代谢物（小檗碱、黄素核苷酸）增加。
- 研究意义
- 本研究为副干酪乳杆菌36作为预防和治疗急性肝损伤的潜在益生菌候选菌株提供了实验依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
动物模型建立与分组处理
建立D-GalN/LPS诱导的急性肝损伤小鼠模型，评价LP36预防效果。
6周龄雄性C57BL/6 SPF小鼠随机分为4组（每组6只）：对照组、LP36组、D-GalN/LPS组和LP36+D-GalN/LPS组。LP36组每日灌胃200 μL 1×10^9 CFU/mL LP36，连续3周；对照组灌胃等量生理盐水。第22天，D-GalN/LPS组和LP36+D-GalN/LPS组腹腔注射600 mg/kg D-GalN和30 μg/kg LPS，对照组和LP36组注射生理盐水。注射后6小时采样。
抗生素清除与粪菌移植（FMT）实验
验证LP36的保肝作用是否依赖于其调节的肠道菌群。
小鼠用抗生素混合物处理一周以清除肠道菌群，然后接受来自对照组或LP36组小鼠的粪便悬浮液灌胃，连续14天。第22天进行D-GalN/LPS造模，6小时后取样。
肝损伤指标检测
评估LP36对D-GalN/LPS诱导的肝损伤的保护作用。
检测血清AST、ALT、TBil水平评估肝功能；检测DAO和D-LA评估肠屏障通透性；进行肝组织H&E染色和改良HAI评分。
氧化应激与炎症因子检测
检测LP36对氧化应激和炎症反应的影响。
检测肝组织T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量；检测血清IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-18、IL-22、TNF-α水平。
细胞凋亡检测
评估LP36对肝细胞凋亡的影响。
通过TUNEL荧光染色检测肝细胞凋亡；通过免疫荧光检测PCNA表达；通过RT-qPCR检测凋亡相关基因（Bcl-2, Bcl-xl, Bax, Caspase 3, Caspase 8, Caspase 9）表达。
肠道屏障功能检测
评估LP36对D-GalN/LPS引起的肠道屏障损伤的保护作用。
通过H&E染色观察回肠组织学变化；通过TEM观察微绒毛和紧密连接超微结构；通过AB-PAS染色和免疫组化检测杯状细胞和MUC2表达；通过免疫荧光检测紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1；通过RT-qPCR检测紧密连接基因（Claudin1, Occludin, ZO-1, MUC2）表达。
肠道菌群分析
分析LP36对肠道菌群组成和多样性的影响。
提取粪便DNA，扩增16S rRNA V3-V4区，在Illumina NovaSeq 6000平台测序，进行OTU聚类、物种注释和多样性分析。
转录组学分析
揭示LP36调节的肝脏基因表达变化和信号通路。
提取肝组织RNA，构建文库，进行Illumina NovaSeq 6000双端测序，分析差异表达基因并进行GO和KEGG富集分析。
代谢组学分析
揭示LP36调节的肝脏代谢物变化和代谢通路。
提取肝组织代谢物，进行UPLC-QTOF-MS检测，识别差异代谢物并进行KEGG通路富集分析。
Western blot验证关键通路蛋白
验证TLR4/NF-κB/MAPK通路和NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化。
提取肝组织蛋白，进行SDS-PAGE和Western blot检测TLR4、MyD88、p-NF-κB、IκBα、JNK、ERK、P38、NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β等蛋白表达。
细胞实验验证
验证LP36调节的肠道菌群代谢物对肝细胞炎症的保护作用是否依赖于TLR4。
用来自LPFMT小鼠肠道内容物的代谢物处理AML12细胞，并给予D-GalN/LPS刺激，部分细胞用TLR4抑制剂TAK242处理，检测相关基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养 | MRS肉汤培养基 | -- | -- |
| 血清指标检测 | AST检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| ALT检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 总胆红素检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 细胞因子检测 | IL-1β ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IL-17A ELISA试剂盒 | MULTI SCIENCES | -- | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | MULTI SCIENCES | -- | |
| IL-22 ELISA试剂盒 | MULTI SCIENCES | -- | |
| 抗氧化能力检测 | 总抗氧化能力检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A015-2 |
| 总超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-1 | |
| 过氧化氢酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A007-1 | |
| 谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A005-1 | |
| 丙二醛检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-1 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A045-3 |
| 透射电镜 | 1%锇酸 | -- | -- |
| Spurr树脂 | -- | -- | |
| 日立H-7650透射电子显微镜 | Hitachi | -- | |
| TUNEL染色 | 蛋白酶K | -- | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 免疫组化 | 辣根过氧化物酶标记二抗 | -- | -- |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus试剂 | Takara | -- |
| PrimeScript II cDNA合成试剂盒 | Takara | -- | |
| HiScript II SYBR Green RT-qPCR试剂盒 | Vazyme | -- | |
| CFX384实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | 裂解缓冲液 | -- | -- |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光试剂 | -- | -- | |
| 微生物组分析 | TGuide S96磁珠法土壤/粪便DNA提取试剂盒 | Tiangen Biotech | -- |
| 微生物组测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
| 转录组学 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NanoDrop 2000紫外分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 代谢组学 | 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱 | Waters Corporation | -- |
| 细胞实验 | TAK242 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、周龄：C57BL/6雄性，6周龄；环境：23±2℃，12小时光/暗循环；预处理剂量：1×10^9 CFU/mL LP36，200 μL/天；造模剂量：600 mg/kg D-GalN和30 μg/kg LPS腹腔注射；取样时间：注射后6小时 阅读提示：Materials and methods: Experimental design |
| 抗生素清除与FMT | 抗生素混合物组成、浓度：氨苄青霉素1 g/L，新霉素1 g/L，甲硝唑1 g/L，万古霉素0.5 g/L，氟康唑20 mg/L；给予时间：1周；粪便悬液来源和灌胃体积：来自对照组或LP36组小鼠的粪便悬液200 μL/天；灌胃时间：14天 阅读提示：Materials and methods: Experimental design (Part II) |
| 氧化应激指标检测 | 检测指标：T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px、MDA；试剂盒货号：A015-2、A001-1、A007-1、A005-1、A003-1；样品制备：肝匀浆1:9 (w/v)，离心4000×g 10分钟；检测波长：T-AOC和CAT 405 nm，T-SOD 450 nm，GSH-Px 412 nm，MDA 532 nm 阅读提示：Materials and methods: Antioxidant capacity assays |
| 细胞因子检测 | 检测指标：IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17A、IL-18、IL-22；使用ELISA试剂盒，具体品牌和货号需要核对 阅读提示：Materials and methods: Cytokine measurements |
| 肠道菌群分析 | DNA提取试剂盒：TGuide S96 Magnetic Soil/Stool DNA Kit；16S rRNA V3-V4引物：338F和806R；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；OTU聚类相似度：97%；数据库：SILVA 阅读提示：Materials and methods: Microbiome analysis |