多组学数据整合与差异表达分析
鉴定CRC中差异表达的PANoptosis相关基因（DE-PANRGs）及其功能富集。
整合GEO和TCGA的CRC转录组数据，进行批次校正，鉴定38个DE-PANRGs，并进行GO和KEGG富集分析。
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机器学习驱动的多组学分析鉴定CHP2为结直肠癌中关键的双功能PANoptosis相关生物标志物
Machine Learning-Driven Multi-Omics Analysis Identifies CHP2 as a Key PANoptosis-Related Dual-Function Biomarker in Colorectal Cancer.
实验完整度
高结合多组学数据与机器学习分析，并通过体外细胞实验（功能、机制）和斑马鱼体内模型进行验证。
主要模型
HCT116细胞系 SW480细胞系 斑马鱼异种移植模型
重点核对
CHP2在CRC中的表达下调及临床相关性（TCGA、UALCAN） 细胞系选择：HCT116（MSI，p53野生型）与SW480（MSS，p53突变型） CHP2过表达对细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用 CHP2过表达对PANoptosis标志物（p-MLKL、N-GSDMD、Cleaved-Caspase3）的影响 低CHP2表达对5-FU、奥沙利铂、伊立替康耐药及对Ribociclib、Lapatinib敏感
摘要
结直肠癌（CRC）的异质性给治疗带来了巨大挑战。我们整合了多组学和机器学习，并通过SHAP模型进行解释以提供临床依据，鉴定出钙调磷酸酶B同源蛋白2（CHP2）作为核心候选基因，并通过体外和斑马鱼模型进一步验证。CHP2在CRC中表达降低，与不良预后和免疫抑制的“冷”肿瘤免疫微环境相关。功能上，CHP2过表达通过诱导PANoptosis抑制细胞生长和侵袭。临床上，特定的CHP2表达谱可区分对标准化疗（如5-FU）耐药但对靶向抑制剂敏感的高风险患者。CHP2是一个强大的双功能生物标志物——既预测生存预后又预测治疗反应——可能引领耐药CRC的个体化治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌中PANoptosis相关基因的失调模式及其作为诊断、预后和治疗反应生物标志物的潜力。
- 核心机制
- CHP2通过诱导PANoptosis（坏死性凋亡、焦亡和凋亡的协同激活）抑制CRC细胞增殖和侵袭；其低表达导致免疫抑制的“冷”肿瘤微环境和广泛的化疗耐药，但增加对特定靶向药物的敏感性。
- 主要证据
- 多组学数据和机器学习鉴定CHP2为关键基因；体外实验显示CHP2过表达抑制HCT116和SW480细胞增殖、迁移和侵袭，并上调p-MLKL、N-GSDMD、Cleaved-Caspase3；斑马鱼异种移植模型证实体内抑瘤作用；药物敏感性实验显示CHP2低表达细胞对5-FU等耐药但对Ribociclib和Lapatinib敏感。
- 研究意义
- CHP2作为双功能生物标志物，可用于结直肠癌的预后风险分层和治疗反应预测，为耐药CRC患者的个体化治疗提供分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
机器学习筛选关键基因
从DE-PANRGs中筛选具有诊断潜力的核心基因。
应用LASSO、SVM-RFE和随机森林三种算法，取交集获得6个关键基因（CHP2、CASP7、SMPD1、FTH1、CAPN2、PIK3CG）。
免疫微环境分析
评估关键基因表达与肿瘤免疫微环境的关系。
使用CIBERSORTx推断22种免疫细胞浸润比例，并分析与关键基因表达的相关性。
通路富集与ceRNA网络构建
探索CHP2相关的生物学通路及上游调控网络。
进行GSVA和GSEA分析，并构建mRNA-miRNA-lncRNA ceRNA网络。
体外功能验证
验证CHP2对CRC细胞恶性表型的影响。
在HCT116和SW480细胞中过表达CHP2，检测细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。
药物敏感性验证
验证CHP2表达对化疗药物和靶向药物敏感性的预测作用。
用不同浓度的化疗药物和靶向药物处理对照和CHP2过表达细胞，测定IC50。
体内验证
在体内模型中验证CHP2过表达对肿瘤生长和迁移的影响。
将SW480对照和CHP2过表达细胞注入斑马鱼卵黄囊，观察肿瘤荧光面积和迁移距离。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
差异表达与功能富集分析
机器学习特征选择与建模
免疫微环境分析
体内实验
表达验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | D6429 |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B | Servicebio | G4015 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270106 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | MCE | HY-K3007 | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | Beyotime | C0351 |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | ST551 | |
| siRNA转染 | Lipo 8000转染试剂 | Beyotime | C0533 |
| RNA提取和qRT-PCR | 总细胞RNA提取试剂盒 | Tiangen | DP419 |
| BeyoRT™ II第一链cDNA合成试剂盒（含gDNA去除剂） | Beyotime | D7170S | |
| miRNA第一链cDNA合成试剂盒（茎环法） | Vazyme | MR101-01 | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 | |
| qRT-PCR | ABI 7300 Plus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8检测试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| Click-iT™ Plus OPP Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher | C10456 | |
| Western blotting | 柱式组织与细胞蛋白提取试剂盒 | Epizyme | PC201 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| CHP2抗体 | Boster | A08478-2 | |
| p-MLKL抗体 | MCE | HY86069 | |
| GSDMD（N端）抗体 | MCE | HY-P85810 | |
| Cleaved Caspase-3抗体 | MCE | HY-P86370 | |
| β-actin抗体 | Servicebio | ZB15001-HRP | |
| ECL化学发光试剂 | Bioswamp | PW9209 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Beyotime | P0096 |
| QuickBlock™封闭液 | Beyotime | P0260 | |
| AF488偶联的山羊抗兔IgG（H+L）二抗 | Beyotime | P0176 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Miraclebio | MRC-C-23011 |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| 结晶紫 | Servicebio | G1014 | |
| 流式细胞术 | Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A218 |
| 体内实验 | CM-Dil细胞膜荧光探针 | Bestbio | BB441924 |
| 药物处理 | 5-氟尿嘧啶 | MCE | -- |
| 奥沙利铂 | MCE | -- | |
| 伊立替康 | MCE | -- | |
| 瑞博西尼 | MCE | -- | |
| 拉帕替尼 | MCE | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus IX71荧光显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（HCT116、SW480、NCM460）的来源、培养基组成（DMEM+10%FBS+1%PSA）、培养条件（37℃，5% CO2）、传代比例和消化方法。 阅读提示：Materials and Methods 2.9 Cell Culture |
| 慢病毒感染 | 病毒滴度（1.25 × 10^6 TU/mL）、聚凝胺浓度（6 μg/mL）、感染时间（24小时）、嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/mL）和筛选时间（一周）。 阅读提示：Materials and Methods 2.10 Lentivirus Infection |
| siRNA转染 | siRNA序列、转染试剂（Lipo 8000）、转染后检测时间（48小时）。 阅读提示：Materials and Methods 2.11 siRNA Transfection and Knockdown Efficiency Validation |
| 细胞增殖检测 | CCK-8和EdU实验的细胞接种密度（1×10^5）、EdU浓度（50 μM）和处理时间（2小时）。 阅读提示：Materials and Methods 2.13 Cell Proliferation |
| Transwell实验 | 细胞接种密度（1×10^5）、基质胶浓度（150 μg/mL）、迁移/侵袭时间（24小时）。 阅读提示：Materials and Methods 2.17 Transwell Migration and Invasion Assays |
| 药物敏感性实验 | 细胞接种密度（5×10^3）、药物处理时间（48小时）、药物浓度梯度。 阅读提示：Materials and Methods 2.14 Drug Sensitivity Assay |
| Western blotting | 抗体稀释比例、蛋白提取方法、内参蛋白（β-actin）。 阅读提示：Materials and Methods 2.15 Western Blotting |
| 斑马鱼实验 | 斑马鱼品系（野生型AB）、注射细胞量、注射体积（约5 nl）、每组样本量（20条）、处理时间（72小时）、温度（28℃）。 阅读提示：Materials and Methods 2.19 In Vivo Functional Validation |