建立感染模型和观察组织嗜性
确定LSDV在不同组织中的感染和复制特性。
建立金黄地鼠感染模型，检测体重、皮肤病变、组织病毒载量；比较MDBK和MAC-T细胞中的病毒生长曲线、形态变化和超微结构。
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细胞死亡调控决定疙瘩皮肤病的组织嗜性
Cell death modulation dictates tissue-specific tropism of lumpy skin disease virus.
实验完整度
高包含体外细胞模型、动物模型及牛临床样本三个证据层级，并明确功能验证（敲低/抑制剂）和机制验证（互作、通路）。
主要模型
MDBK细胞（牛肾细胞） MAC-T细胞（牛乳腺细胞） 金黄地鼠感染模型 牛肾脏和乳腺组织样本
重点核对
LSDV感染剂量（MOI=1） 感染时间点（2、8、16、24 hpi用于转录组；12-96 hpi用于凋亡检测） 动物模型：3周龄雄性金黄地鼠，皮下注射1 mL 106 TCID50/mL LSDV，对照组注射PBS GAPDH和GSDMC的siRNA敲低效率 凋亡和焦亡标志物的检测（Cleaved Caspase-3、GSDMC-N）
摘要
疙瘩皮肤病病毒（LSDV）是一种关键的跨界病原体，可在牛、水牛和其他反刍动物中引起毁灭性感染。该病毒诱导典型的临床表现，包括皮肤结节、产奶量显著减少和生产性能受损，给全球畜牧业造成严重的经济损失。尽管LSDV表现出显著的多组织嗜性和在多种器官中的持续病毒脱落，对疾病控制构成重大挑战，但其组织特异性适应的分子机制仍知之甚少。在此，我们建立了牛细胞模型和金黄地鼠模型来阐明LSDV的组织特异性致病机制，并进一步在牛肾脏和乳腺组织样本中验证了这些发现以证明其在自然宿主中的相关性。我们的研究结果表明，LSDV在不同组织中使用不同的细胞死亡途径来促进宿主适应。在肾组织中，病毒包膜蛋白ORF117与宿主GAPDH特异性相互作用，触发其核转位并随后激活GAPDH-Siah1/p53信号级联，最终导致Caspase-3介导的凋亡。相反，在乳腺组织中，LSDV诱导Caspase-8依赖性GSDMC的切割，促进乳腺上皮细胞的焦亡和大量炎性细胞因子IL-1β和IL-18的释放。这项研究首次提供了LSDV组织特异性激活不同细胞死亡途径的分子基础机制见解，为开发针对疙瘩皮肤病的靶向治疗干预建立了理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LSDV如何在肾脏和乳腺组织中表现出不同的细胞死亡模式，其分子机制是什么？
- 核心机制
- 在肾脏细胞中，LSDV包膜蛋白ORF117与宿主GAPDH相互作用，促进GAPDH核转位并激活GAPDH-Siah1/p53通路，诱导Caspase-3介导的凋亡；在乳腺细胞中，LSDV通过Caspase-8切割GSDMC，释放GSDMC-N，促进焦亡及炎性细胞因子释放。
- 主要证据
- 细胞模型（MDBK和MAC-T）中凋亡和焦亡标志物检测、转录组分析、互作实验（Co-IP、GST pull-down）、基因敲低和抑制剂实验，以及在金黄地鼠和牛组织中的验证。
- 研究意义
- 首次揭示LSDV组织特异性激活不同细胞死亡通路的分子机制，为开发针对疙瘩皮肤病的靶向治疗和疫苗改进提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析转录组筛选细胞死亡通路
识别LSDV感染后激活的信号通路。
对LSDV感染的MDBK细胞进行RNA-seq，对MAC-T细胞进行相同处理；KEGG富集分析细胞死亡相关通路。
验证细胞死亡表型
确认LSDV在两种细胞中诱导凋亡和焦亡。
通过TUNEL、TEM、Annexin V/PI染色和流式细胞术检测凋亡；通过LDH释放、ELISA和TEM检测焦亡。
鉴定效应蛋白
确定LSDV诱导凋亡的关键病毒蛋白。
克隆LSDV包膜蛋白基因并表达GFP融合蛋白，通过Caspase-3/7活性筛选。
研究凋亡的分子机制
阐明ORF117诱导凋亡的机制。
通过GST pull-down和质谱鉴定ORF117相互作用蛋白，Co-IP验证，分析GAPDH核转位及下游通路。
研究焦亡的分子机制
阐明LSDV在MAC-T细胞中诱导焦亡的机制。
检测gasdermin家族表达，验证GSDMC切割和Caspase-8激活，使用siRNA敲低和抑制剂处理。
体内验证
在动物和自然宿主中验证组织特异性细胞死亡。
检测金黄地鼠和牛组织中凋亡和焦亡标志物及细胞因子水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Scientific | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 细胞活力测定 | CCK-8试剂盒 | Yeasen | -- |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL原位凋亡试剂盒 | Elabscience | -- |
| Caspase 3/7活性检测试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 蛋白互作 | 谷胱甘肽琼脂糖珠 | Smart Lifesciences | -- |
| 焦亡检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Yeasen | -- |
| 阳性对照 | 星孢菌素 | MCE | -- |
| 抑制剂处理 | Z-VAD-FMK | Felix | -- |
| Z-IETD-FMK | Felix | -- | |
| ELISA | 牛IL-1β ELISA试剂盒 | Meikebio | -- |
| 牛IL-18 ELISA试剂盒 | Meikebio | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PMSF | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol | -- | -- |
| SteadyPure通用RNA提取试剂盒 | Accurate Biotechnology | -- | |
| 反转录 | Evo M-MLV反转录试剂盒 | -- | -- |
| 转染 | Hieff Trans脂质体转染试剂 | Yeasen | -- |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质粒构建 | pEGFP-N1载体 | -- | -- |
| pcDNA3.1-Myc(+)载体 | -- | -- | |
| pcDNA3.1-FLAG(+)载体 | -- | -- | |
| pGEX-4T-1载体 | -- | -- | |
| siRNA转染 | siRNA-Mate plus转染试剂 | -- | -- |
| 蛋白表达纯化 | IPTG | -- | -- |
| Western blot | ECL检测系统 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗体 | 鼠抗Myc单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 兔抗Flag单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG二抗 | Proteintech | -- | |
| Alexa Fluor 647标记山羊抗兔IgG二抗 | Proteintech | -- | |
| 兔抗DYKDDDDK标签多克隆抗体 | Proteintech | -- | |
| Histone H3多克隆抗体 | Proteintech | -- | |
| GAPDH多克隆抗体 | Proteintech | -- | |
| Alpha Tubulin多克隆抗体 | Proteintech | -- | |
| Caspase 3/p17/p19兔多抗 | Proteintech | -- | |
| DFNA5/GSDME多克隆抗体 | Proteintech | -- | |
| Caspase 3（活性）兔单克隆抗体 | Beyotime | -- | |
| GSDMC兔多克隆抗体 | Abclonal | -- | |
| Siah1多克隆抗体 | Abclonal | -- | |
| GSDMD重组兔单克隆抗体 | Bioworlde | -- | |
| Cleaved-Caspase 8 (Asp384)抗体 | Affinity Biosciences | -- | |
| 动物实验 | 金黄地鼠 | Beijing Vitalriver Laboratory Animal Technology Co. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒感染 | 感染复数（MOI）和感染时间点 阅读提示：Methods: Cells and viruses; Results: Fig 1E, Fig 2E, Fig 6C |
| 凋亡检测 | 细胞系（MDBK）、感染时间点、Annexin V/PI染色步骤 阅读提示：Methods: Flow cytometry for apoptosis detection; Results: Fig 2D-2E |
| 焦亡检测 | 细胞系（MAC-T）、LDH释放检测时间和MOI 阅读提示：Methods: Lactate dehydrogenase release assay; Results: Fig 6C |
| 蛋白互作 | 质粒构建、GST pull-down条件、Co-IP抗体 阅读提示：Methods: GST pull-down assay, Co-immunoprecipitation |
| 动物实验 | 动物品系、年龄、接种剂量、接种途径、样本采集时间 阅读提示：Methods: Animal experiment; Results: Fig 1D |
| 临床样本 | 牛组织样本来源、病毒载量、检测方法 阅读提示：Methods: Ethics statement; Results: Fig 5G-5H, S7 Fig |