建立衰老模型并实施干预
建立D-半乳糖诱导的衰老模型,并验证定期治疗性放血(PTP)干预的效果。
SD大鼠和C57BL/6J小鼠每日皮下注射D-半乳糖(150 mg/kg)8周建立衰老模型,造模4周后分为PTP/1w(每周放血)和PTP/2w(每2周放血)组,放血量为总循环血量的6%。
Periodic Therapeutic Phlebotomy Mitigates Systemic Aging Phenotypes by Promoting Bone Marrow Function.
研究包含D-半乳糖诱导的衰老大鼠和小鼠模型,进行了行为学、组织病理学、分子表达、电生理、流式细胞术等多层级验证,并初步探讨了骨髓微环境机制。
D-半乳糖诱导的衰老SD大鼠模型 D-半乳糖诱导的衰老C57BL/6J小鼠模型
D-半乳糖注射剂量:150 mg/kg,每日皮下注射,持续8周 治疗性放血方案:每周1次(PTP/1w)或每2周1次(PTP/2w),放血量约为总循环血量的6% 动物品系:SD大鼠(雄性)和C57BL/6J小鼠(雄性和雌性) 行为学测试:Y迷宫、Morris水迷宫、旷场实验、 treadmill、悬尾实验、强迫游泳实验 统计方法:单因素或双因素方差分析,多重比较采用Tukey或Bonferroni事后检验
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立D-半乳糖诱导的衰老模型,并验证定期治疗性放血(PTP)干预的效果。
SD大鼠和C57BL/6J小鼠每日皮下注射D-半乳糖(150 mg/kg)8周建立衰老模型,造模4周后分为PTP/1w(每周放血)和PTP/2w(每2周放血)组,放血量为总循环血量的6%。
检测PTP对衰老相关的认知和运动功能的影响。
通过Y迷宫、Morris水迷宫、旷场实验、跑步机实验、悬尾实验和强迫游泳实验评估大鼠和小鼠的认知功能、运动能力、焦虑和抑郁样行为。
评估PTP对衰老相关组织器官结构和分子改变的影响。
通过SA-β-gal染色、免疫组化、油红O染色、天狼星红染色、HE染色、Masson染色、micro-CT和Western blot等方法检测大鼠和小鼠肝脏、肾脏、骨骼肌、骨骼、主动脉、皮肤、心脏和十二指肠等组织器官的衰老相关变化。
探讨PTP对衰老相关的神经发生和神经元功能的影响。
通过免疫荧光染色检测海马齿状回区域DCX、SOX2、Ki67、ASCL1、IL-6、CDKN2A、CDKN2B和p-γH2A.X的表达,并通过电生理记录小鼠海马脑片的LTP、fEPSP和mEPSC,以及高尔基染色和Sholl分析评估神经元形态。
评估PTP对衰老相关外周血和免疫器官功能的影响。
通过Luminex多重蛋白分析检测血浆中SASP因子水平,ELISA检测Klotho、Taurine、TGF-β1、TPO水平,生化分析检测MDA、SOD、GSH-PX等,流式细胞术分析外周血、胸腺和脾脏中T细胞和B细胞比例,并检测胸腺和脾脏中SA-β-gal阳性细胞。
探究PTP对骨髓造血功能和微环境的影响。
通过SA-β-gal染色评估骨髓衰老水平,ELISA检测骨髓中TGF-β1和TPO水平,流式细胞术分析骨髓中造血干细胞和祖细胞亚群比例,以及内皮细胞亚群,并通过细胞培养检测BMSCs的增殖、细胞周期、凋亡和衰老标记物表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | D-半乳糖 | Absin | abs816779 |
| 组织包埋 | Tissue-Tek O.C.T.包埋剂套装 | Sakura | 4583 |
| SA-β-gal染色 | 衰老细胞组织学染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| ELISA | Klotho ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R2580c |
| 牛磺酸ELISA试剂盒 | Absin | abs580222 | |
| TGF-β1 ELISA试剂盒 | Multi Sciences | EK981 | |
| TPO ELISA试剂盒 | Fine Test | ER0202 | |
| 血液学分析 | BC-2800 Vet全自动动物血细胞分析仪 | Mindray | -- |
| 血液生化分析 | Chemray-800生化分析仪 | Rayto | -- |
| 免疫组织化学 | p-γH2A.X抗体 | Abclonal | AP0687 |
| HMGB1抗体 | Wanleibio | WL03023 | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| Desmin抗体 | Wanleibio | WL0174 | |
| 山羊抗兔IgG(H+L)二抗 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 31460 | |
| 免疫荧光 | DCX抗体 | RD | ab207175 |
| SOX-2抗体 | RD | AF2018 | |
| Ki67抗体 | Novus | NBP2-22112SS | |
| ACSL1抗体 | Affinity | DF8504 | |
| GFAP抗体 | Affinity | DF6040 | |
| CDKN2A抗体 | Santa Cruz | Sc-1661 | |
| CDKN2B抗体 | Invitrogen | PA5-49749 | |
| IL-6抗体 | Abclonal | A21264 | |
| NO成像 | DAF-2DA | Glpbio Technology Inc. | -- |
| 电生理 | 振动切片机VT1200 | Leica | -- |
| Axopatch 700B放大器 | Molecular Devices | -- | |
| Golgi染色 | Pannoramic MIDI II系统 | 3DHISTECH | -- |
| Western blotting | 全细胞裂解检测试剂盒 | Wanleibio | WLA019 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Wanleibio | WLA004 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Wanleibio | WLA013 | |
| p53抗体 | Wanleibio | WL01919 | |
| p27抗体 | Wanleibio | WL04174 | |
| p21抗体 | Wanleibio | WL0362 | |
| p16抗体 | Wanleibio | WL01418 | |
| p-tau抗体 | Abclonal | AP1096 | |
| tau-5抗体 | Affinity | AF6141 | |
| NEFL抗体 | Proteintech | 12998-1-AP | |
| SIRT2抗体 | Proteintech | 19655-1-AP | |
| GH1抗体 | Proteintech | 55243-1-AP | |
| IGF抗体 | Abclonal | A11985 | |
| β-actin抗体 | Wanleibio | WL01372 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Servicebio | G4510 |
| 胎牛血清 | TIANHANG | 11011-8611 | |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | Wanleibio | WLA010a |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-PI凋亡检测试剂盒I | Wanleibio | WLA001a |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | BioTeke | RP1001 |
| BeyoRT II M-MLV反转录试剂盒 | Beyotime | D7160L | |
| micro-CT | Skyscan 1276系统 | Bruker | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | D-半乳糖注射剂量为150 mg/kg,每日皮下注射,持续8周;对照组注射等量生理盐水。 阅读提示:Material and Methods 4.1 Animals and Drug Treatments |
| 定期治疗性放血 | 放血量约为总循环血量的6%,频率为每周1次或每2周1次;大鼠和小鼠总循环血量分别约为64 mL/kg和72 mL/kg。 阅读提示:Material and Methods 4.2 Periodic Therapeutic Phlebotomy and Blood Sample Collection |
| 行为学评估 | Y迷宫、Morris水迷宫、旷场实验、跑步机实验等行为学测试的具体参数和条件。 阅读提示:Material and Methods 4.4-4.12 |
| 组织衰老检测 | SA-β-gal染色、免疫组化等检测的组织来源、切片厚度、抗体使用及定量方法。 阅读提示:Material and Methods 4.13, 4.14, 4.18, 4.19 |
| 骨髓分析 | 流式细胞术分析骨髓造血干细胞和祖细胞亚群的抗体组合和门控策略。 阅读提示:Material and Methods 4.23 Flow Cytometry of Hematopoietic Cells and Niche Cells |
| 电生理记录 | 海马脑片制备条件、ACSF成分、LTP诱导协议、mEPSC记录条件等。 阅读提示:Material and Methods 4.21 Electrophysiology |