构建不同刚度的PAAm水凝胶并表征
模拟结直肠癌进展过程中的基质刚度变化，为细胞培养提供底物。
合成不同刚度（2、21、37、47、56 kPa）的PAAm水凝胶，并用旋转流变仪测量其杨氏模量。
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通过蛋白质组学解析结直肠癌中基质刚度驱动的变化
Deciphering Stiffness-Driven Changes in Colorectal Cancer by Proteomics.
实验完整度
高包含基于TMT的定量蛋白质组学、细胞形态分析、正交验证（dot blot、ELISA）、功能实验（迁移、血管生成、基质降解）及生物信息学分析。
主要模型
KM12L4a细胞（高转移性结直肠癌细胞系） KM12C细胞（低转移性结直肠癌细胞系） CAF CT5.3细胞（癌症相关成纤维细胞） HUVEC细胞（人脐静脉内皮细胞）
重点核对
基质刚度（2 kPa vs 47 kPa） 血清饥饿条件（48小时） 细胞接种密度（1.5 x 10^6 cells/cm^2） 功能实验中分泌组的添加量（5 μl 或 25 μl 冻干分泌组） 统计阈值（FDR ≤ 0.05，倍数变化 ≥1.5或≤0.67）
摘要
肿瘤硬化在癌症进展中起着关键作用。由癌细胞与其周围微环境相互作用导致的肿瘤刚度增加，改变了肿瘤的机械特性，并显著影响癌症生长和转移，而转移是癌症相关死亡的主要原因。尽管肿瘤刚度很重要，但系统研究其对蛋白质失调影响的报道仍然有限。在本研究中，我们聚焦于结直肠癌，通过深度蛋白质组学表明，基质刚度显著改变分泌蛋白的表达，而细胞内蛋白水平基本不受影响。功能实验揭示，由基质刚度驱动的蛋白质组学观察到的分泌组变化，增强了细胞迁移、血管生成和基质重塑，这些在真实情境下共同促进更具侵袭性的癌症表型。我们的发现强调了基质刚度通过分泌组变化驱动结直肠癌进展的关键作用，为开发生物力学癌症疗法提供了有价值的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 基质刚度如何影响结直肠癌细胞的蛋白质组，特别是分泌蛋白质组，并影响癌症进展相关功能？
- 核心机制
- 基质刚度调控肿瘤细胞分泌组选择性重编程，通过改变分泌蛋白表达，增强细胞迁移、血管生成和基质重塑，从而促进更具侵袭性的癌症表型。
- 主要证据
- 基于TMT的定量蛋白质组学显示，刚度显著改变分泌蛋白（1445个差异蛋白）而细胞内蛋白影响甚微；功能实验证实软基质（2kPa）分泌组增强KM12C迁移约3倍，并促进HUVEC血管生成。
- 研究意义
- 揭示基质刚度作为细胞外动态的调节因子，机械敏感性分泌表型可能成为结直肠癌的新靶点，为生物力学癌症疗法提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞培养和样品收集
在不同刚度基质上培养CRC细胞，收集细胞蛋白和分泌蛋白用于蛋白质组学分析。
在PAAm水凝胶和玻璃对照上培养KM12L4a细胞，经血清饥饿后收集条件培养基和细胞沉淀。
TMT标记和LC-MS/MS分析
定量比较不同刚度条件下细胞内和分泌蛋白质组的表达差异。
使用TMT试剂标记细胞裂解物和分泌组样品，经LC-MS/MS分析，数据通过MaxQuant处理。
差异蛋白鉴定和生物信息学分析
鉴定刚度相关的差异表达蛋白，并分析其功能和分泌途径。
基于标准化报告离子强度进行统计检验，鉴定差异蛋白，并利用GO、Reactome、SecretomeP等工具进行功能富集和分泌途径预测。
正交法验证差异蛋白
验证LC-MS/MS发现的差异蛋白，并扩展细胞因子表达分析。
使用Dot blot验证12种蛋白，使用细胞因子抗体微阵列检测80种细胞因子，并用ELISA验证VEGF、IL-8、CXCL1和OPG。
功能实验评估分泌组对细胞行为的影响
探究刚度调节的分泌组对细胞迁移、血管生成和基质重塑的影响。
使用伤口愈合实验评估迁移，血管生成实验评估HUVEC管形成，明胶降解实验评估CAF介导的基质降解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 水凝胶功能化 | 硫代-SANPAH | Merck | 803332 |
| I型胶原蛋白 | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31053028 |
| 胎牛血清 | Merck | F7524 | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| 庆大霉素 | Carl Roth | 2475.1 | |
| 内皮细胞基础培养基-2 | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuots添加剂 | Lonza | CC-4176 | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0022 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0010 | |
| 蛋白质定量 | PageRuler Plus预染蛋白分子量标准 | Thermo Fisher Scientific | 26619 |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Merck | T8787 |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dot blot | Bio-Dot 96孔微过滤装置 | Bio-Rad | 729261 |
| 丽春红S | Merck | P3504 | |
| ECL Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| SuperSignal West Femto最大灵敏度底物 | Thermo Fisher Scientific | 34096 | |
| ELISA | 人IL-8夹心ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00006 |
| 人CXCL1夹心ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00133 | |
| 人VEGF夹心ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00216 | |
| 人OPG ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1341 | |
| RNA提取 | NZYol试剂 | NZYtech | -- |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNeasy微型试剂盒 | Qiagen | -- | |
| cDNA合成 | NZY第一链cDNA合成试剂盒 | NZYtech | -- |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq II | Takara | -- |
| Light Cycler 480 | Roche | -- | |
| 伤口愈合 | 伤口愈合插件 | Ibidi | 80209 |
| 血管生成 | 基质胶 | Merck | CLS356234 |
| μ-Slide血管生成腔室 | Ibidi | 81506 | |
| 明胶降解 | 多聚赖氨酸 | Merck | P8920 |
| 明胶 | Merck | G1890 | |
| FITC标记明胶 | AnaSpec | AS-85145 | |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| 流式分析 | 台盼蓝 | -- | -- |
| 显微镜 | Leica DM IL LED显微镜 | Leica | -- |
| Leica TCS SP8显微镜 | Leica | -- | |
| Leica THUNDER成像仪 | Leica | -- | |
| 流变学表征 | Discovery HR-2旋转流变仪 | TA Instruments | -- |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TMT试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 图像采集 | Amersham ImageQuant 800 | Cytiva | -- |
| 图像分析 | Fiji | -- | -- |
| Imaris Viewer | Oxford Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PAAm水凝胶制备 | 不同刚度凝胶的配方（AAm和MBAA浓度），以及凝胶功能化时sulfo-SANPAH和胶原I的用量。 阅读提示：见方法部分：Polyacrylamide (PAAm) Hydrogels, Hydrogel Synthesis 和 Hydrogel Functionalization。 |
| 细胞培养和饥饿处理 | 细胞接种密度（1.5 x 10^6 cells/cm^2），培养时间（24h），饥饿时间（48h）及无血清培养基。 阅读提示：见方法部分：Cell Culture, Seeding, Growing, and Starving Cells on PAAm Gels。 |
| 蛋白质组学分析 | TMT标记的样品准备（细胞10 μg，分泌组900 μl），以及LC-MS/MS分析参数（梯度2h，FDR阈值）。 阅读提示：见方法部分：Protein Extraction and Quantification, TMT Labeling, LC-MS/MS Analysis。 |
| 差异蛋白验证 | Dot blot、ELISA和细胞因子阵列中使用的样本量（生物学重复数），以及用于比较的条件（2 kPa vs 47 kPa）。 阅读提示：见方法部分：Dot Blot, Cytokine Array, ELISA。 |
| 功能实验 | 伤口愈合、血管生成和明胶降解实验中分泌组的来源和用量，以及细胞类型。 阅读提示：见方法部分：Functional Assays (Wound Healing, Angiogenesis, Gelatin Degradation)。 |