CIA大鼠模型的建立与验证
建立类风湿关节炎动物模型，评估黄芩苷的治疗效果。
使用牛Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂诱导SD大鼠产生CIA，通过关节炎评分评估模型成功，并分组给予黄芩苷或地塞米松治疗21天。
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蛋白质组学与代谢组学整合分析揭示黄芩苷在CIA大鼠FLS中的抗炎机制
Integrated Analysis of Proteomics and Metabolomics Uncovered the Anti-Inflammatory Mechanisms of Baicalin in CIA Rat FLS.
实验完整度
高包含CIA大鼠模型、FLS原代培养、体内药效评估、蛋白质组学与代谢组学整合分析及Western blot和荧光验证，具备多层级实验验证。
主要模型
CIA大鼠模型 CIA大鼠膝关节滑膜组织来源的成纤维样滑膜细胞（FLS）
重点核对
雄性SD大鼠，7周龄，体重150 ± 10 g，随机分组（正常组、模型组、黄芩苷组、地塞米松组） 黄芩苷给药剂量60 mg/kg/day，腹腔注射，每天一次，从第21天开始治疗21天 FLS用黄芩苷50 µg/mL处理48小时 关节炎评分 >2 作为CIA模型纳入标准
摘要
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是持续性滑膜炎，其中成纤维样滑膜细胞（FLSs）是驱动关节破坏的主要效应细胞。黄芩苷此前已被证明能显著改善CIA大鼠的关节症状。因此，本研究旨在通过整合蛋白质组学和转录组学分析，探讨其潜在的分子机制及其对CIA大鼠FLSs的影响。基于两个数据集进行了京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析；结果显示，与RA易感性相关的逆行内源性大麻素信号通路是黄芩苷调节的信号和代谢过程中唯一共同参与的通路。黄芩苷下调的19个差异表达蛋白（DEPs）包括17个NADH脱氢酶亚基和2个受体，即谷氨酸受体2（GRIA2）和γ-氨基丁酸受体亚基α-5（GABRA5）。黄芩苷还影响了3种差异代谢物（DMs）：γ-氨基丁酸（GABA）和磷脂酰胆碱（PC）上调，磷脂酰乙醇胺（PE）下调。我们的研究结果表明，黄芩苷介导的关节滑膜炎缓解与GABA和PC的上调、GRIA2、GABRA5和PE的下调以及FLSs中逆行内源性大麻素信号通路内线粒体稳态的维持密切相关。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 黄芩苷通过何种分子机制改善CIA大鼠的关节滑膜炎？
- 核心机制
- 黄芩苷可能通过上调GABA和PC，下调GRIA2、GABRA5和PE，并维持逆行内源性大麻素信号通路中的线粒体稳态来发挥抗炎作用。
- 主要证据
- 整合蛋白质组学和代谢组学分析显示，逆行内源性大麻素信号通路是黄芩苷调节的信号和代谢过程中唯一共同通路；Western blot和荧光分析验证了NDUFV1、GRIA2和GABRA5的表达下调。
- 研究意义
- 这些结果可能有助于扩大RA的临床治疗策略范围。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
炎症因子和病理学检测
评估黄芩苷对CIA大鼠全身及局部炎症的影响。
通过ELISA检测血清IL-6、IL-10和IL-17水平，通过H&E染色观察踝关节滑膜组织炎症浸润情况。
FLS原代培养与鉴定
获得用于后续体外实验的CIA大鼠FLS。
从CIA大鼠后膝关节滑膜组织分离FLS，原代培养至第三代用于实验。
蛋白质组学分析
鉴定黄芩苷处理后FLS中差异表达蛋白。
采用TMT标记定量蛋白质组学，分析对照组和黄芩苷组（50 µg/mL处理48小时）的蛋白表达差异，并进行GO和KEGG富集分析。
代谢组学分析
鉴定黄芩苷处理后FLS中差异代谢物。
采用液相色谱-质谱联用技术进行代谢组学分析，筛选差异代谢物，并进行KEGG通路富集分析。
蛋白质组与代谢组整合分析
寻找黄芩苷调节的共同信号和代谢通路。
将蛋白质组和代谢组数据进行KEGG通路富集，比较信号通路和代谢通路的交集，确定共同通路。
关键蛋白验证
验证蛋白质组学结果中关键蛋白的表达变化。
选择NDUFV1、GRIA2和GABRA5进行Western blot和免疫荧光实验，验证黄芩苷处理后的蛋白表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 牛Ⅱ型胶原 | Chondrex, Inc. | -- |
| 完全弗氏佐剂 | Shanghai Canspec Scientific Instruments Co., Ltd. | C55-R10291 | |
| 药物处理 | 黄芩苷 | Kehua AI Innovative Drug Research and Development Co., Ltd. | -- |
| 地塞米松 | Sinopharm Ronshyn Pharmaceutical Co., Ltd. | H41020035 | |
| 细胞培养 | D-Hanks溶液 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | Hejun Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Hejun Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| IL-17 ELISA试剂盒 | Hejun Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 组织学处理 | EDTA脱钙液 | Biosharp | BL518A |
| 蛋白质组学 | 尿素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Merck Millipore | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- | |
| TMT标记试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Strata X C18固相萃取柱 | Phenomenex | -- | |
| Agilent 300 Extend C18色谱柱 | Agilent | -- | |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢组学 | Vanquish系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱 | Waters | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 抗NDUFV1抗体 | Elabscience | E-AB-11436 | |
| 抗GRIA2抗体 | Diagbio | db11905 | |
| 抗GABRA5抗体 | Zenbio | R383011 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC026 | |
| 抗GAPDH抗体 | Biosharp | BOAR-00007-A | |
| 二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| New Super ECL化学发光试剂盒 | Biosharp | BL520B | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 荧光二抗 | Proteintech | SA00014-5 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 蛋白质组学 | MaxQuant软件 | Max Planck Institute of Biochemistry | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CIA模型制备 | 大鼠品系、性别、周龄、体重、胶原剂量、免疫次数、间隔时间、注射部位、关节炎评分标准及入选阈值 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| 药物治疗 | 黄芩苷和地塞米松的剂量、给药途径、给药频率、治疗持续时间、对照组处理 阅读提示：Materials and Methods 2.2 |
| FLS分离培养 | 滑膜组织来源、组织块培养条件（培养基、血清浓度、气体环境、培养时间）、细胞传代代数 阅读提示：Materials and Methods 2.3 |
| 蛋白质组学 | 细胞处理条件（黄芩苷浓度、处理时间）、裂解方法、酶解步骤、TMT标记、色谱柱类型、质谱仪型号、数据库、筛选阈值、生物学重复数 阅读提示：Materials and Methods 2.6 |
| 代谢组学 | 样品前处理（溶剂比例、超声时间、离心条件）、色谱柱型号、质谱参数、筛选阈值、生物学重复数 阅读提示：Materials and Methods 2.7 |
| Western blot | 蛋白提取和定量方法、SDS-PAGE浓度、转膜条件、封闭条件、一抗和二抗的稀释度、孵育时间、检测试剂 阅读提示：Materials and Methods 2.8 |
| 免疫荧光 | 细胞接种密度、培养时间、固定剂和透化剂浓度、封闭液、抗体浓度和孵育时间、封片剂 阅读提示：Materials and Methods 2.9 |