iNSC的培养与准备
为后续的同位素示踪和多组学分析提供健康的iNSC细胞培养物。
使用neuronal induction medium（NIM）培养iNSC，并在Matrigel包被的板上进行维持和传代。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用稳定同位素示踪评估诱导神经干细胞脂质生成活性的实验方案
Protocol for stable isotopic tracing to assess cellular lipogenic activity in induced neural stem cells.
实验完整度
中方案包含细胞培养、稳定同位素示踪、代谢物/脂质/蛋白质提取以及质谱检测，但缺乏功能验证或机制验证实验。
主要模型
诱导神经干细胞（iNSC）单层培养
重点核对
使用[13C6]-葡萄糖（20.4 mM）和[13C5,15N2]-谷氨酰胺（3.2 mM）进行同位素示踪 示踪时间点：30分钟（糖酵解）、6小时和24小时 细胞每孔至少200,000个用于代谢组学分析 细胞培养板规格：12孔板 三种生物学重复，每种处理三个孔
摘要
本文介绍了一种利用稳定同位素示踪评估诱导神经干细胞（iNSCs）脂质生成表型的实验方案。我们描述了iNSCs的培养与制备、使用[13C6]-葡萄糖和[13C5,15N2]-谷氨酰胺进行标记，以及随后从同一样品中依次提取代谢物、脂质和蛋白质的步骤。该方案支持基于单样本、质谱的多组学工作流程，适用于稳态分析、稳定同位素示踪以及蛋白质翻译后修饰的表征。关于该方案的使用和执行的完整细节，请参阅Ionescu等人的文献。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用稳定同位素示踪评估诱导神经干细胞（iNSCs）的脂质生成活性？
- 核心机制
- 文中未明确说明，该方案旨在通过稳定同位素示踪和单样本多组学分析描述脂质生成表型。
- 主要证据
- 通过使用[13C6]-葡萄糖和[13C5,15N2]-谷氨酰胺进行示踪，并随后从同一细胞样本中顺序提取代谢物、脂质和蛋白质，以进行UHPLC-MS分析。
- 研究意义
- 该方案支持基于单样本的质谱多组学工作流程，适用于稳态分析、稳定同位素示踪以及蛋白质翻译后修饰的表征。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
稳定同位素示踪
标记iNSC以评估代谢途径中的同位素富集。
在示踪日，将培养基替换为含有[13C6]-葡萄糖或[13C5,15N2]-谷氨酰胺的相应NIM，并在指定时间点收集样品。
样品收集
收集条件培养基和细胞，用于后续代谢组学分析。
收集培养基并离心去除细胞碎片；收集细胞并用PBS洗涤、离心、计数，然后快速冷冻。
代谢物提取
从细胞和细胞上清中提取代谢物，用于UHPLC-MS分析。
使用代谢物提取溶液（MES）提取代谢物，包括涡旋、离心，并制备QC样品和自动进样小瓶。
脂质提取
从代谢物提取后的剩余沉淀中提取脂质，用于脂质组学分析。
使用冷甲醇提取脂质，混合后离心，然后制备脂质组学的自动进样小瓶和QC样品。
蛋白质消化与提取
从代谢物和脂质提取后的沉淀中提取蛋白质，制备肽段用于蛋白质组学分析。
用含有SDS的TEAB溶解沉淀，进行还原和烷基化，然后使用S-Trap柱进行酶解，并洗脱肽段。
UHPLC-MS数据采集与分析
获取代谢组学、脂质组学和蛋白质组学数据。
使用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）系统分别在正负离子模式下采集代谢组学和脂质组学数据，蛋白质组学使用Evosep One-timsTOF Pro系统。
数据分析
处理质谱数据，进行代谢物鉴定和稳定同位素示踪分析。
使用El-Maven进行代谢物鉴定，使用LipidSearch进行脂质鉴定，使用MS Convert和Mascot或FragPipe进行蛋白质鉴定，并使用Scaffold验证搜索结果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | Cat#1002096887 |
| DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | Cat#11320033 | |
| 无葡萄糖DMEM/F12培养基 | Elabscience | Cat#EP-CM-L0127-ELA | |
| 无谷氨酰胺DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | Cat#21331020 | |
| Neurobasal A培养基 | Thermo Fisher Scientific | Cat#21103049 | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat#35050038 | |
| B-27添加剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat#17504044 | |
| N-2添加剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat#17502001 | |
| CHIR99021 | Cell Guidance Systems | Cat#SM13 | |
| 人白血病抑制因子 | Cell Signaling Technology | Cat#62226S | |
| SB-431542 | Cayman Chemicals | Cat#13031 | |
| Y-27632 | Miltenyi Biotec | Cat#130-103-933 | |
| 低生长因子Matrigel基质胶 | Corning | Cat#354230 | |
| Accutase细胞分离液 | Thermo Fisher Scientific | Cat#A1110501 | |
| XF 1.0 M葡萄糖溶液 | Agilent | Cat#103577-100 | |
| 稳定同位素示踪 | 13C6标记D-葡萄糖 | Thermo Fisher Scientific | Cat#389374 |
| 13C5,15N2标记L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | Cat#607983 | |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | Cat#D2650 |
| 乙酸 | Carolina | Cat#841289 | |
| KnockOut血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | Cat#10828028 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | Cat# A456 | |
| 水 | Fisher Scientific | Cat#W64 | |
| 质谱分析 | 含0.1%甲酸的水（Optima LC/MS） | Fisher Scientific | Cat# LS118 |
| 蛋白质组学 | 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | Cat#L3771 |
| 三乙基碳酸氢铵（1 M） | Sigma-Aldrich | Cat# 18597 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | Cat#D9779 | |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | Cat#09830 | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | Cat# U5378 | |
| 磷酸 | Sigma-Aldrich | Cat#452289 | |
| 测序级胰蛋白酶 | Promega | Cat#V5113 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | Cat# A461 | |
| 校准溶液 | Fisher Scientific | Cat#PI88323 and PI88324 | |
| S-Trap微型离心柱 | Protifi | Cat#C02-micro | |
| Vivacon 500离心过滤器，10k MWCO | Fisher Scientific | Cat#14558344 | |
| Pierce C18离心吸头 | Thermo Scientific | Cat#84850 | |
| Evotips Pure吸头 | EvoSep | EV2013 | |
| 细胞培养 | 玻璃量筒，1L | Fisher Scientific | Cat#08-549-11F |
| 带盖玻璃瓶，1 L | Fisher Scientific | Cat#06-414-1D | |
| 质谱分析 | 代谢组学液相色谱柱 - ACQUITY BEH C18，2.1 × 100 mm，1.7 μm | Waters | Cat#186002352 |
| 样品处理 | 锥形离心管，50 mL | Fisher Scientific | Cat#14-432-22 |
| 微量离心管，1.7 mL | Axygen | Cat#MCT175LC | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | Cat#022620659 | |
| 自动进样瓶 | Phenomenex | Cat#AR0-39P2-13 | |
| 自动进样瓶盖 | Phenomenex | Cat#AR0-8972-13 | |
| 真空离心浓缩仪 | Labconco | Cat#7983013 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iNSC培养 | 细胞系：iNSC；培养板：12孔板，Matrigel包被；培养基：NIM（含CHIR99021 3 μM、hLIF 10 ng/mL、SB-431542 2 μM等）；培养条件：5% CO2，37°C；传代比例：1:10-1:30 阅读提示：参见“Maintenance and passaging of iNSCs”和“Preparation of Matrigel-coated plates” |
| 稳定同位素示踪 | 示踪底物：20.4 mM [13C6]-葡萄糖（葡萄糖示踪）或3.2 mM [13C5,15N2]-谷氨酰胺（谷氨酰胺示踪）；示踪时间点：30分钟、6小时、24小时；培养基：无葡萄糖/无谷氨酰胺NIM 阅读提示：参见“iNSC preparation for isotopic tracing” |
| 样品收集 | 细胞收集：Accutase消化，用冷PBS洗涤，离心300×g 5分钟，快速冷冻；上清收集：离心去除细胞碎片，取100 μL于-80°C保存 阅读提示：参见“Medium and cell collection following isotopic tracing” |
| 代谢物提取 | 提取溶剂：甲醇/乙腈/水(5:3:2)；细胞密度：2×10^6细胞/mL；涡旋：4°C 30分钟；离心：14,000×g 10分钟 阅读提示：参见“Metabolite extraction for cells and cell supernatants” |
| 脂质提取 | 提取溶剂：冷甲醇；细胞密度：4×10^6细胞/mL；涡旋：4°C 30分钟；离心：18,213×g 10分钟 阅读提示：参见“Lipid extraction for cells and cell supernatants following metabolomics processing” |
| 蛋白质组学处理 | 裂解液：4% SDS in 100 mM TEAB；还原：10 mM DTT，55°C 30分钟；烷基化：25 mM IAM，避光30分钟；消化：37°C 6小时（S-Trap）或过夜（FASP） 阅读提示：参见“Sample processing for proteomics—Cells”和“Sample processing for proteomics—Conditioned media/cell supernatants” |
| 质谱数据采集 | 代谢组学：Vanquish UHPLC-Q Exactive，色谱柱Acquity BEH C18，梯度5分钟，正负离子模式；脂质组学：Vanquish UHPLC-Q Exactive，色谱柱Kinetex C18，梯度5分钟；蛋白质组学：Evosep One-timsTOF Pro，梯度88分钟 阅读提示：参见表1-8及相应的“Metabolomics data acquisition parameters”、“Lipidomics data acquisition parameters”、“Proteomics data acquisition parameters” |