构建重组LSDV报告病毒
建立用于高通量药物筛选的灵敏定量平台
利用CRISPR-Cas9在LSDV基因组的ORF50和ORF51之间插入mCherry和荧光素酶报告基因，构建rLSDV，并通过空斑实验、qPCR、Western blot和电镜验证其生物学特性与野生型一致。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抗正痘病毒药物通过靶向病毒DNA聚合酶抑制牛结节性皮肤病病毒的复制
Anti-orthopoxvirus drugs inhibit lumpy skin disease virus replication by targeting viral DNA polymerase.
实验完整度
高包含报告病毒构建与表征、药物筛选、时间添加实验、核酸合成检测、RNA-seq分析、结构预测等多个独立证据层级，并包含机制验证。
主要模型
MDBK细胞 Vero细胞 BHK-21细胞 重组牛结节性皮肤病病毒（rLSDV）
重点核对
rLSDV报告基因（mCherry/荧光素酶）插入位点为ORF50与ORF51间 药物筛选浓度：初筛使用Table 1中列出的浓度，例如AraC为0.5 μM 时间添加实验：分别在感染前、感染中、感染后添加药物，处理72小时 AraC处理条件：0.5 μM，用于DNA合成检测、RNA-seq及病毒复制周期实验 细胞系MDBK和Vero，MOI为0.1或1，具体根据实验阶段
摘要
牛结节性皮肤病（LSD）是由牛结节性皮肤病病毒（LSDV）引起的一种新出现的跨界疾病，在缺乏有效药物的情况下对全球牛健康构成重大威胁。在此，我们构建了表达mCherry和荧光素酶双报告基因的重组LSDV（rLSDV）用于高通量药物筛选，该rLSDV保留了与亲本株在表型上无法区分的病毒学特性，报告基因可作为病毒复制的精确且灵敏的定量指标。利用这一平台，我们从抗正痘病毒化合物库中鉴定出六种候选药物，即阿糖胞苷（AraC）、恩诺沙星（ENR）、碘苷（IDU）、法拉昔定（FIAU）、利巴韦林（RBV）和阿糖腺苷（AraA），这些药物表现出高抗病毒活性和低细胞毒性。时间添加实验表明，所有鉴定的候选药物主要抑制病毒复制阶段。机制分析显示，抗LSDV药物抑制病毒和宿主DNA和/或RNA的合成。特别是，AraC显著阻断病毒DNA合成并阻止病毒晚期基因启动子的激活，从而在早期阶段阻滞复制周期。结构比对数据提示，AraC可能结合病毒DNA聚合酶的D554、R639、K666、N670和D758残基从而抑制其活性。值得注意的是，AraC仅诱导极小的宿主DNA损伤和细胞凋亡，且治疗期间宿主DNA合成逐渐恢复，尽管这些残基在牛DNA聚合酶中也是保守的。因此，本文描绘的机制图景，加上抗正痘病毒药物已确立的临床可用性，强调了它们作为LSDV感染可再利用治疗药物的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能有效抑制LSDV复制的候选药物，并揭示其作用机制。
- 核心机制
- AraC通过靶向病毒DNA聚合酶（结合残基D554、R639、K666、N670、D758）抑制病毒DNA合成，从而阻断病毒晚期基因转录和复制周期进程。
- 主要证据
- 基于rLSDV的高通量筛选鉴定出六种药物；时间添加实验显示主要抑制复制阶段；EdU标记实验表明AraC抑制病毒DNA合成；qPCR验证DNA含量无增加；报告病毒实验证明晚期基因表达被阻断；结构比对预测AraC与病毒DNA聚合酶结合。
- 研究意义
- 这些化合物具有临床可用性，可作为LSDV感染的候选治疗药物，并提示病毒DNA聚合酶是可行的抗病毒靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
抗正痘病毒药物库筛选
鉴定具有抗LSDV活性的化合物
在MDBK细胞中，以rLSDV感染，用荧光素酶活性检测候选化合物的抑制率，并用mCherry荧光成像验证，初步筛选出六种抑制率>90%的化合物，然后用从另一供应商购买的化合物在WT LSDV上进行验证。
测定CC50和IC50并计算选择指数
评估候选药物的安全性和有效性
使用CCK-8测定细胞活力以计算CC50，通过荧光素酶活性测定计算IC50，并在MDBK和Vero细胞中计算SI。
时间添加实验
确定药物作用的病毒生命周期阶段
在四个阶段（病毒直接灭活、感染前、感染中、感染后）添加药物，通过荧光素酶活性和mCherry荧光评估抗病毒效果。
DNA合成检测
评估候选药物对病毒和宿主DNA合成的影响
使用EdU标记实验检测新合成的DNA，通过共聚焦显微镜观察，并用qPCR定量病毒DNA水平。
RNA合成检测
评估候选药物对病毒和宿主RNA合成的影响
使用EU标记实验检测新合成的RNA，通过共聚焦显微镜观察。
AraC细胞毒性评估
评估AraC在抗病毒浓度下的宿主细胞毒性
通过RNA-seq分析转录组变化，Western blot检测凋亡和DNA损伤标志物，流式细胞术检测细胞凋亡，并使用抑制剂探讨凋亡或坏死性凋亡是否参与抗病毒作用。
AraC对病毒复制周期的影响
阐明AraC对病毒早期和晚期基因表达的影响
在高MOI感染下，检测病毒滴度、DNA含量、早晚期蛋白和mRNA表达，并使用EGFP报告病毒验证。
结构预测
预测AraC与LSDV DNA聚合酶的结合模式
使用AlphaFold3预测LSDV和牛DNA聚合酶结构，并与MPXV DNA聚合酶结构比对，分析Ara-CTP结合位点。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Servicebio | -- |
| 胎牛血清 | ExCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | YEASEN | -- | |
| 重组病毒构建 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| BbsI限制性内切酶 | Thermo Fisher | -- | |
| T4 DNA连接酶 | YEASEN | -- | |
| 无缝克隆试剂盒 | Beyotime | -- | |
| DNA纯化试剂盒 | YEASEN | -- | |
| 无内毒素质粒提取试剂盒 | TIANGEN | -- | |
| 细胞培养 | 甲基纤维素 | Beyotime | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Cytiva | -- |
| Super ECL检测试剂 | YEASEN | -- | |
| 自动化化学发光成像系统 | Tanon | -- | |
| 抗体剥离缓冲液 | Cwbio | -- | |
| qPCR | 细胞/组织DNA提取试剂盒 | YEASEN | -- |
| SYBR Green qPCR预混液 | YEASEN | -- | |
| QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RNAiso Plus试剂 | Takara | -- | |
| Hifair II第一链cDNA合成预混液 | YEASEN | -- | |
| IC50检测 | 荧光素酶报告基因检测试剂盒 | YEASEN | -- |
| DNA/RNA合成检测 | BeyoClick EdU细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| BeyoClick EU细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-APC/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| BD Accuri C6流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- | |
| 电镜 | HITACHI HT7800透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Vazyme | -- |
| 药物筛选 | 阿糖胞苷 | MedChemExpress | 147-94-4 |
| 恩诺沙星 | MedChemExpress | 93106-60-6 | |
| 碘苷 | MedChemExpress | 54-42-2 | |
| 法拉昔定 | MedChemExpress | 69123-98-4 | |
| 利巴韦林 | MedChemExpress | 36791-04-5 | |
| 阿糖腺苷 | MedChemExpress | 5536-17-4 | |
| 伊维菌素 | MedChemExpress | 70288-86-7 | |
| Western blot | 抗裂解Caspase-3抗体 | HUABIO | -- |
| 抗裂解PARP1抗体 | HUABIO | -- | |
| 抗磷酸化MLKL (S345)抗体 | HUABIO | -- | |
| 抗磷酸化组蛋白H2A.X (S139)抗体 | Beyotime | -- | |
| 抗β-肌动蛋白小鼠单克隆抗体 | Epizyme | -- | |
| 抗β-微管蛋白小鼠单克隆抗体 | Epizyme | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Epizyme | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Epizyme | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG (H+L) | Invitrogen | -- |
| RNA-seq | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Illumina TruSeq RNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| 重组病毒构建 | PX458质粒 | Addgene | #48138 |
| pVAX1质粒 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 报告病毒构建 | CRISPR-Cas9质粒（rPX458-sgRNA1+2）的设计，插入位点（ORF50和ORF51之间），转染和感染参数 阅读提示：Materials and methods, Construction of recombinant virus |
| 药物筛选 | 初筛时的药物浓度（见Table 1），感染MOI（0.1），处理时间（72小时） 阅读提示：Results, Identification of anti-LSDV compounds; Table 1 |
| CC50和IC50测定 | 细胞系（MDBK和Vero），药物系列稀释（3倍，最大100 μM），处理时间（72小时） 阅读提示：Materials and methods, Half-maximum cytotoxic concentration (CC50) and Half-maximal inhibitory concentration (IC50) |
| 时间添加实验 | 药物浓度（ENR 100 μM, IDU 20 μM, FIAU 5 μM, RBV 20 μM, AraC 0.5 μM, AraA 20 μM），感染MOI（0.1） 阅读提示：Materials and methods, Time-of-addition assay |
| DNA合成检测 | 感染MOI（1），药物处理时间（24 hpi，1小时），EdU浓度（10 μM）和标记时间（1小时） 阅读提示：Materials and methods, Assessment of DNA or RNA synthesis |
| RNA合成检测 | 感染MOI（1），药物处理时间（24 hpi，1小时），EU浓度（100 μM）和标记时间（1小时） 阅读提示：Materials and methods, Assessment of DNA or RNA synthesis |
| AraC细胞毒性评估 | AraC浓度（0.5, 1, 2 μM），感染MOI（1），处理时间（48小时），RNA-seq生物重复数（3） 阅读提示：Results, AraC elicits marginal cytotoxicity regardless of LSDV infection; Materials and methods, RNA-seq |
| 病毒复制周期 | 感染MOI（10），AraC浓度（0.5 μM），时间点（3, 6, 12, 24 hpi） 阅读提示：Results, AraC blocks the transcription of viral late genes; Figure 7 legend |
| 结构预测 | AlphaFold3模型，序列比对 阅读提示：Results, Structural basis underlying AraC inhibition of LSDV DNA polymerase |