细胞共培养模型建立
建立生理相关的角质形成细胞-成纤维细胞共培养模型,以模拟皮肤微环境。
人角质形成细胞(hKT)和成纤维细胞(CCD1072SK)在Transwell共培养系统中培养,hKT接种于上室,成纤维细胞接种于下室,以评估旁分泌效应。
Dermofunctional Vehicle Downregulates LL-37 and MMPs and Upregulates IGFBP-3.
研究包含体外共培养模型下的细胞活力、细胞因子/MMP检测、Western blot及RT-qPCR等多层级实验,验证了Cleoderm™的免疫调节和基质保护功能,但缺乏体内模型和患者样本验证。
人角质形成细胞与成纤维细胞Transwell共培养模型 LPS刺激的炎症共培养模型
Cleoderm™浓度:1.0%和10.0%(v/v) LPS刺激浓度:1 μg/mL,处理24小时 细胞预处理:Cleoderm™预处理1小时后与LPS共孵育24小时 检测指标:IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β、MMP-1/3/13、LL-37、IGFBP-3 统计分析:至少三次独立实验,t检验或单因素方差分析,p<0.05
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立生理相关的角质形成细胞-成纤维细胞共培养模型,以模拟皮肤微环境。
人角质形成细胞(hKT)和成纤维细胞(CCD1072SK)在Transwell共培养系统中培养,hKT接种于上室,成纤维细胞接种于下室,以评估旁分泌效应。
确定Cleoderm™的非细胞毒性浓度,为后续功能实验选择安全剂量。
hKT和成纤维细胞暴露于不同浓度Cleoderm™(0.01%、0.1%、1.0%、10%)24小时,通过MTT和台盼蓝排除法评估细胞活力。
评估Cleoderm™对LPS诱导的炎症反应的调节作用。
共培养细胞分为五组:对照、LPS(1 μg/mL)、LPS+Cleoderm™ 1.0%、LPS+Cleoderm™ 10.0%和Cleoderm™ 10.0%。细胞用Cleoderm™预处理1小时,然后与LPS共孵育24小时。
定量分析Cleoderm™对炎症和基质重塑相关蛋白的影响。
收集细胞培养上清液,通过ELISA检测IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β、MMP-1、MMP-3和MMP-13的分泌水平。通过RT-qPCR检测对应基因的mRNA表达。
评估Cleoderm™对LL-37、IGFBP-3和TGF-β蛋白表达的影响,这些与痤疮和红斑痤疮病理相关。
通过Western blot分析细胞裂解液中LL-37、IGFBP-3和TGF-β蛋白水平,β-tubulin作为内参。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | Cleoderm™ | Fagron BV | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 碳酸氢钠 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞毒性检测 | MTT试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blot | Bradford检测试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 抗LL-37抗体 | AFG Bioscience | -- | |
| 抗TGF-β抗体 | Elabscience | -- | |
| 抗IGFBP-3抗体 | AFG Bioscience | -- | |
| HRP偶联二抗 | Jackson Immuno Research Laboratories | -- | |
| ECL化学发光试剂 | GE Healthcare | -- | |
| RT-qPCR | SuperScript® III逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- |
| ELISA | IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-10、MMP-1、MMP-3、MMP-13 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 细胞共培养 | Transwell小室 | Corning | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型 | 人角质形成细胞系和CCD1072SK人成纤维细胞;细胞代数在第3至第12代之间;共培养比例角质形成细胞:成纤维细胞为1:6 阅读提示:参见Materials and Methods 2.2 Cell Culture and Treatment |
| 药物处理 | Cleoderm™浓度1.0%和10.0%(v/v);LPS刺激浓度1 μg/mL;预处理1小时,共孵育24小时 阅读提示:参见Materials and Methods 2.2 Cell Culture and Treatment |
| 细胞毒性评估 | MTT和台盼蓝实验的操作细节,包括细胞密度、孵育时间和读数方法 阅读提示:参见Materials and Methods 2.3 Cytotoxicity Assays |
| 分子表达检测 | ELISA和RT-qPCR的检测试剂盒、内参基因、引物序列、PCR条件和数据分析方法 阅读提示:参见Materials and Methods 2.4-2.6及Table 1 |