生物信息学预测与蛋白结构评估
评估候选蛋白的理化性质、溶解度、抗原性、免疫原性、致敏性和毒性。
使用ProtParam、Protein-Sol、ANTIGENpro、IEDB等服务器预测蛋白特性；使用AlphaFold2构建3D结构，Ramachandran图和ProSA验证。
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牛结节性皮肤病病毒亚单位疫苗在小鼠中诱导显著的体液和细胞介导免疫反应
The subunit vaccine of Lumpy skin disease virus elicits significant humoral and cell-mediated immune responses in mice.
实验完整度
中包括原核表达、纯化、免疫小鼠、ELISA、中和试验、ELISpot、流式细胞术、qPCR等，但缺少攻毒保护实验等体内功能验证，未进行牛体实验。
主要模型
BALB/c小鼠
重点核对
小鼠品系：BALB/c，6周龄雌性SPF级 免疫剂量：100μg蛋白/只，皮下注射 免疫方案：第0天和14天共免疫两次 使用完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂 ELISA检测：不同抗原包被浓度、血清稀释度和二抗稀释度需优化
摘要
牛结节性皮肤病（LSD）是一种影响牛的新出现系统性传染病。目前，该病没有特效治疗方法，接种疫苗以增强免疫力仍然是预防LSD最直接有效的方法。在本研究中，我们从牛结节性皮肤病病毒（LSDV）中选择了具有优势抗原特性的ORF073、ORF075、ORF090和ORF110蛋白，构建、表达和鉴定重组原核表达载体。纯化的蛋白质用于免疫小鼠。通过监测抗体分泌和免疫相关基因的表达，初步评估了亚单位疫苗的免疫效力。结果表明，用ORF075和ORF090亚单位疫苗免疫的小鼠产生了较高水平的抗体反应，并诱导了Th1/Th2偏向的免疫应答。免疫小鼠的脾细胞在体外用疫苗抗原刺激时，表现出更高水平的T细胞免疫应答。这些发现表明，本研究开发的LSDV ORF075和ORF090亚单位疫苗成功诱导了小鼠体内强大的体液和细胞免疫应答，从而为后续在牛自然宿主中的实验提供了数据基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估LSDV ORF073、ORF075、ORF090和ORF110四种蛋白作为亚单位疫苗候选抗原在小鼠中的免疫原性。
- 核心机制
- ORF075和ORF090亚单位疫苗诱导Th1/Th2混合型免疫应答。
- 主要证据
- 小鼠免疫ORF075和ORF090后产生高抗体滴度，脾细胞体外抗原再刺激后IFN-γ分泌显著增加，CD4+和CD8+ T细胞比例升高。
- 研究意义
- 为后续在牛（自然宿主）中进行疫苗保护效力评估提供数据基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组蛋白表达与纯化
在大肠杆菌中表达并纯化LSDV ORF073、ORF075、ORF090、ORF110蛋白。
基因合成并克隆至pCold-II载体，转化BL21(DE3)菌株，IPTG诱导表达，纯化后SDS-PAGE和Western blot验证。
小鼠免疫与抗体应答评估
评估四种蛋白亚单位疫苗在小鼠中诱导的体液免疫应答。
将纯化蛋白与佐剂混合免疫BALB/c小鼠，定期采血，用ELISA检测IgG、IgG1、IgG2a抗体水平，计算IgG2a/IgG1比值，并检测中和抗体。
细胞免疫应答评估
评估疫苗诱导的T细胞免疫应答。
分离免疫小鼠脾细胞，用ELISpot检测IFN-γ分泌，流式细胞术分析CD4+和CD8+ T细胞比例。
免疫相关基因mRNA表达检测
检测脾脏中免疫相关细胞因子（IL-4、IL-6、TNF-α、IL-10）的表达水平。
提取脾脏RNA，qRT-PCR检测细胞因子mRNA表达，以GAPDH为内参，用2^-ΔΔCt法计算相对表达量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | pCold-II载体 | Tsingke Biotechnology | -- |
| 蛋白诱导表达 | 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白质定量试剂盒 | Solarbio | -- |
| Western blot | 小鼠抗His标签单克隆抗体 | Proteintech | -- |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP二抗 | Proteintech | -- | |
| 免疫佐剂 | 完全弗氏佐剂 | Sigma | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma | -- | |
| ELISA | HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | -- |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG1 | Proteintech | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG2a | Proteintech | -- | |
| 淋巴细胞分离 | 小鼠脾淋巴细胞分离试剂盒 | TBD | -- |
| ELISpot | 小鼠IFN-γ酶联免疫斑点检测试剂盒 | MABTECH | -- |
| 流式细胞术 | FITC标记的抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | -- |
| PE标记的抗小鼠CD8抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | Elabscience | -- | |
| 中和试验 | MDBK细胞 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达 | 表达条件：0.5 mM IPTG，16°C，20h 阅读提示：详见Materials and methods 2.4 |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系、年龄、性别；免疫剂量、途径、时间间隔 阅读提示：详见Materials and methods 2.5 |
| ELISA检测 | 抗原包被浓度、血清稀释度、二抗稀释度需优化 阅读提示：详见Materials and methods 2.6 |
| ELISpot检测 | 脾细胞数、刺激抗原浓度 阅读提示：详见Materials and methods 2.9 |
| 流式细胞术 | 抗体用量、染色时间、洗涤次数 阅读提示：详见Materials and methods 2.10 |