建立永生化的颗粒细胞系
通过hTERT基因转染原代颗粒细胞，建立具有稳定增殖能力的细胞系。
分离自C57BL/6小鼠早期窦状卵泡的原代颗粒细胞，使用携带hTERT基因的慢病毒载体转染，经嘌呤霉素筛选后获得IMG-A1细胞系。
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IMG-A1：一种用于研究FSH依赖性卵泡发生和卵巢病理生理的新型永生化颗粒细胞系
IMG-A1: A Novel Immortalized Granulosa Cell Line for Investigating FSH-Dependent Folliculogenesis and Ovarian Pathophysiology.
实验完整度
高包含细胞系建立（慢病毒转染hTERT）、分子表征（qRT-PCR、Western blot）、功能验证（激素刺激、ELISA、增殖检测）及核型分析等多个独立证据层级，并进行药理学验证。
主要模型
小鼠颗粒细胞系IMG-A1 人颗粒细胞肿瘤系COV434
重点核对
原代颗粒细胞分离自C57BL/6小鼠（2月龄，腹腔注射5IU PMSG后36小时） 细胞培养条件：DMEM/F-12培养基，添加10% FBS、1× GlutaMAX、100 nM雄烯二酮、1%青霉素-链霉素 激素处理：0.1 UE/mL重组人FSH（GONAL-f）、0.1 UE/mL hCG（Chorulon）、0.1 UE/mL PMSG处理48小时 芳香化酶抑制：1 µM来曲唑处理48小时；代谢紊乱模拟：100 nM睾酮和/或100 nM胰岛素处理48小时 统计分析：至少三次独立生物学重复，数据以mean ± SEM表示，p<0.05为显著
摘要
卵巢生物学的研究受限于缺乏能忠实再现颗粒细胞（GC）生理的体外模型。原代GC的寿命有限，而大多数永生化细胞系来源于肿瘤，表现出非生理性的激素反应。本研究旨在开发和表征一种具有稳定、生理相关表型的新型永生化GC细胞系。我们使用慢病毒载体将人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因导入来自早期窦状卵泡的原代小鼠颗粒细胞，从而创建了IMG-A1细胞系。通过分子（qRT-PCR、Western blot）、细胞遗传学（核型分析）和功能性（激素刺激、ELISA、增殖实验）方法对该细胞系进行了广泛表征，以评估其表型及对促性腺激素和代谢应激物的反应。IMG-A1细胞表现出非转化表型，保持稳定的核型，并表达卵泡刺激素受体（FSHR），但不表达黄体生成素/绒毛膜促性腺激素受体（LHCGR）。相应地，它们对FSH的反应是上调类固醇生成基因如芳香化酶（Cyp19a1），但对LH/hCG无反应。此外，该细胞系对激素刺激表现出生理相关的反应，包括FSH强烈诱导芳香化酶，以及在高雄激素和高胰岛素环境下其协同上调。IMG-A1细胞系是早期窦状颗粒细胞的独特而稳健的模型，为研究FSH依赖性卵泡发生、卵巢病理生理的细胞方面以及药物发现提供了有价值的新工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在开发并表征一种新型永生化颗粒细胞系，以克服现有模型的局限性，提供生理相关、稳定的体外工具，用于研究FSH依赖性卵泡发生和卵巢病理生理。
- 核心机制
- IMG-A1细胞系通过稳定表达FSHR而缺失LHCGR，从而选择性响应FSH，促进芳香化酶（Cyp19a1）等类固醇生成基因上调；同时，高雄激素和高胰岛素环境协同上调芳香化酶蛋白并诱导凋亡标志物Caspase-3表达，模拟病理状态下的颗粒细胞功能障碍。
- 主要证据
- 通过qRT-PCR、Western blot、ELISA、免疫细胞化学、流式细胞术及核型分析等技术，证明IMG-A1细胞具有稳定的早期窦状颗粒细胞表型和FSHR+/LHCGR-受体谱；功能实验显示FSH特异性诱导Cyp19a1、Cyp17a1和Inha表达，而hCG无效应。
- 研究意义
- 该细胞系为研究FSH依赖性卵泡发生、卵巢病理生理（如PCOS）的细胞机制及高通量药物筛选提供了稳健的体外平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基本特征表征（增殖、衰老、核型）
评估IMG-A1细胞的增殖能力、衰老状态和基因组稳定性。
通过MTT实验、Ki67免疫细胞化学、SA-β-gal染色、微核计数、流式细胞术和核型分析评估细胞增殖、衰老和核型。
分子表型验证（颗粒细胞标志物）
确认IMG-A1细胞表达早期窦状颗粒细胞的特征性分子标记。
通过qRT-PCR和Western blot检测FOXL2、Nr5a2、Runx2、Cyp19a1、Fshr、Lhcgr等基因和蛋白的表达。
功能性激素反应验证
验证IMG-A1细胞对FSH的选择性反应，以及对LH/hCG的无反应性。
用FSH、hCG、PMSG处理IMG-A1细胞48小时，通过qRT-PCR检测Cyp19a1、Cyp17a1、Inha、Star、Cyp11a1等基因表达变化。
药物和代谢应激反应验证
评估IMG-A1细胞对芳香化酶抑制剂和代谢紊乱（雄激素和胰岛素）的反应。
用letrozole（芳构化酶抑制剂）处理细胞，检测雌二醇分泌和芳香化酶蛋白水平；用睾酮和/或胰岛素处理，检测类固醇生成、凋亡和增殖相关基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物处理 | Sergon | Bioveta Inc. | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| GlutaMAX补充剂 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 转染 | pRSV-Rev质粒 | Addgene | 12253 |
| pMDLg/pRRE质粒 | Addgene | 12251 | |
| pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 | |
| pBABE-neo-hTERT质粒 | Addgene | 1774 | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | PanEco | -- |
| 热灭活胎牛血清 | Capricorn Scientific | -- | |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 转染 | 聚凝胺 | neoFroxx | -- |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Gibco | -- |
| 细胞传代 | 胰蛋白酶-EDTA | PanEco | -- |
| 激素处理 | GONAL-f（重组人FSH） | Merck | -- |
| Chorulon（人绒毛膜促性腺激素） | Merck & Co., Inc. | -- | |
| 孕马血清促性腺激素 | Sergon | -- | |
| 药物处理 | 来曲唑 | Sigma-Aldrich | -- |
| 睾酮 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 增殖检测 | MTT（噻唑蓝） | PanEco | -- |
| 二甲基亚砜 | PanEco | -- | |
| 衰老检测 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Carl Roth | -- |
| RNase A | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 核型分析 | 诺考达唑 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | ExtractRNA试剂 | Evrogen | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 逆转录 | M-MLV逆转录酶 | Evrogen | -- |
| qPCR | qPCRmix-HS SYBR + HighROX试剂盒 | Evrogen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 免疫细胞化学 | DAPI | Sigma-Aldrich | -- |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | PE CD29（整合素β1）单抗 | Thermo Fisher Scientific | 12-0291-82 |
| PE CD34大鼠单抗 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-AB-F1284D | |
| PE CD45大鼠单抗 | BD Biosciences | 553081 | |
| BV 510 CD90.2（Thy1.2）大鼠单抗 | BioLegend | 105335 | |
| 免疫细胞化学 | Ki67兔多抗 | Servicebio Technology | GB111141 |
| ABflo® 488偶联山羊抗兔IgG（H+L） | ABClonal | AS053 | |
| Western blot | 芳香化酶（CYP19A1）兔多抗 | ABClonal | A12684 |
| TERT兔单抗 | ABClonal | A4774 | |
| FOXL2兔多抗 | ABClonal | A16244 | |
| AMH兔多抗 | Thermo Fisher Scientific | PA5-35851 | |
| HSP90兔多抗 | Merck KGaA | SAB4300541 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Labs | 111-035-144 | |
| ELISA | 雌二醇ELISA试剂盒 | Immunotech | -- |
| 细胞培养 | COV434细胞系 | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系建立 | 原代颗粒细胞分离细节：C57BL/6小鼠2月龄，PMSG处理5 IU，36小时后取材；慢病毒转染条件：转染密度、转染时间、病毒滴度 阅读提示：见Methods 2.2节 |
| 细胞培养 | 培养基组成：DMEM/F-12 + 10% FBS + 1× GlutaMAX + 100 nM雄烯二酮 + 1%青霉素-链霉素；传代比例和操作 阅读提示：见Methods 2.3节 |
| 激素刺激实验 | 处理浓度和持续时间：FSH、hCG、PMSG均为0.1 UE/mL，处理48小时 阅读提示：见Methods 2.3节和Results 3.3节 |
| 药物处理 | letrozole浓度1 µM处理48小时；睾酮、胰岛素各100 nM单独或联合处理48小时 阅读提示：见Methods 2.3节和Results 3.4节 |
| 分子检测 | qRT-PCR内参基因Rps18和Tbp；Western blot内参HSP90；ELISA操作按试剂盒说明 阅读提示：见Methods 2.6-2.10节 |