数据收集与预处理
获取乳腺癌基因表达和临床数据,为后续分析奠定基础。
从TCGA数据库获取BRCA基因表达和临床数据,共741个样本;从GEO获取GSE7390数据集,共198个样本。
Construction of a human epidermal growth factor receptor 2-related gene risk model for predicting breast cancer prognosis.
包含生物信息学分析、RT-qPCR验证和细胞功能实验,但缺乏体内实验和独立队列验证。
TCGA-BRCA队列(741例) GSE7390数据集(198例) HER2阳性乳腺癌细胞系BT474、SKBR-3 HER2阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468
TCGA和GSE7390数据集的样本量及临床信息完整性 RT-qPCR验证的临床样本来源(6例HER2阴性、6例HER2阳性)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取乳腺癌基因表达和临床数据,为后续分析奠定基础。
从TCGA数据库获取BRCA基因表达和临床数据,共741个样本;从GEO获取GSE7390数据集,共198个样本。
识别HER2阴性和阳性组之间的差异表达基因及其富集通路。
使用limma包进行差异表达分析,筛选出251个DEGs,并进行GO和KEGG富集分析。
构建基于关键基因的预后风险模型并评估其预测能力。
通过单因素Cox、LASSO和逐步Cox回归筛选出8个关键基因,构建风险评分模型,并在TCGA和GSE7390数据集中验证。
构建可视化列线图以预测患者生存概率。
基于年龄、M分期和风险评分构建列线图,并评估其区分度和校准度。
分析不同风险组间的免疫细胞浸润差异及关键基因在单细胞水平的表达。
使用CIBERSORT、ssGSEA和xCELL评估免疫细胞浸润,并利用GSE161529数据集进行单细胞分析。
验证关键基因在临床样本中的表达差异。
收集6例HER2阴性和6例HER2阳性乳腺癌样本,提取RNA后逆转录并定量PCR检测8个关键基因的表达。
验证ELOVL2对HER2阳性乳腺癌细胞增殖的影响及其机制。
将ELOVL2过表达质粒转染至BT474和SKBR-3细胞,通过CCK-8检测细胞增殖,Western blot检测PI3K/AKT通路蛋白。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 逆转录 | QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | 205311 |
| qPCR | SYBR Green I荧光染料 | Bio-Rad | 1708882 |
| CFX96 Bio-Rad系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 11875093 |
| 胎牛血清 | Gibco; Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen; Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂 | Dojindo Laboratories | CK04 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0013B |
| 蛋白定量 | BCA试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| Western blot | PVDF膜 | MilliporeSigma | -- |
| PI3K (p110 alpha)抗体 | Cell Signaling Technology | 4255 | |
| 磷酸化PI3K (p85/p55)抗体 | Cell Signaling Technology | 17366 | |
| AKT (pan)抗体 | Cell Signaling Technology | 4685 | |
| 磷酸化AKT (Ser473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 山羊抗兔IgG (H+L)过氧化物酶偶联抗体 | Wuhan Elabscience Biotechnology | E-AB-1003 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H+L)过氧化物酶偶联抗体 | Wuhan Elabscience Biotechnology | E-AB-1001 | |
| ECL Plus Western印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据收集与预处理 | TCGA-BRCA队列和GSE7390数据集的样本量、筛选标准(排除OS时间0天或缺失生存数据的样本) 阅读提示:Materials and methods: Data collection and preprocessing |
| 差异表达分析 | 阈值:|log2FC|≥0.585,adj. P<0.05;富集分析阈值:count>2,adj. P<0.05 阅读提示:Materials and methods: Identification of differentially expressed genes |
| 预后模型构建 | 单因素Cox P<0.05,LASSO 10倍交叉验证,逐步Cox回归选择的8个基因 阅读提示:Materials and methods: Construction of a prognostic risk model |
| RT-qPCR验证 | 临床样本来源(6例HER2阴性、6例HER2阳性)、患者年龄32-69岁、内参基因GAPDH、3次技术重复 阅读提示:Materials and methods: Reverse transcription-quantitative PCR |
| 细胞实验 | 细胞系(BT474、SKBR-3、MDA-MB-468)、转染浓度(2 µg per 1×10^6 cells)、CCK-8接种密度(1×10^4 cells/well) 阅读提示:Materials and methods: Cell culture and transfection; CCK-8 assay |