临床样本收集与特征分析
比较冠心病患者与对照组的基本临床资料和血脂水平。
纳入96例冠心病患者和98例对照,收集外周血,检测空腹血糖和血脂指标。
TBL1XR1 Promotes Coronary Artery Disease by Regulating Triglyceride Metabolism via the PPAR Pathway.
包含临床样本检测、细胞功能验证和统计相关性分析,但缺乏动物模型和体内验证。
人肝细胞L-02 冠心病患者外周血样本
TBL1XR1 mRNA和蛋白在外周血中的表达(RT-PCR和Western blot) TBL1XR1表达与甘油三酯水平及Gensini评分的相关性 siRNA敲低TBL1XR1后PPARα表达变化 siRNA敲低TBL1XR1后细胞内甘油三酯水平变化
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较冠心病患者与对照组的基本临床资料和血脂水平。
纳入96例冠心病患者和98例对照,收集外周血,检测空腹血糖和血脂指标。
验证TBL1XR1在冠心病患者外周血中的表达是否异常。
提取外周血总RNA和蛋白,通过RT-PCR和Western blot检测TBL1XR1 mRNA和蛋白表达。
评估TBL1XR1表达与冠心病风险及严重程度的关系。
进行Logistic回归分析风险因素,计算TBL1XR1与甘油三酯、Gensini评分的相关性,并绘制ROC曲线。
验证TBL1XR1敲低对肝细胞甘油三酯代谢的影响及其机制。
培养人肝细胞L-02,设计三种siRNA干扰TBL1XR1表达,检测敲低效率后,用50% FBS培养基诱导TG合成,测定PPARα表达和TG水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640完全培养基 | KeyGEN BioTECH | KGM31800S |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Solarbio | P1400 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 |
| OPTI-MEM减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985-062 | |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Tiangen | DP419 |
| 反转录 | 反转录试剂盒 | TOYOBO | FSQ-101 |
| RT-PCR | SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | Takara | RR420A |
| 外周血单个核细胞分离 | 外周血淋巴细胞分离液 | Haoyang | LTS1077 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Elabscience | E-BC-K318 | |
| 小鼠抗β-肌动蛋白抗体 | TransGen | HC201 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Servicebio | GB23301 | |
| 兔抗TBL1XR1抗体 | Abclonal | A7834 | |
| 兔抗PPARα抗体 | Affinity | AF5301 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB23303 | |
| TG含量测定 | 甘油三酯测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A110-1-1 |
| RT-PCR | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 |
| CFX Connect荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | 184-1000 | |
| Western blot | Tanon-5200全自动化学发光成像系统 | Tanon Science & Technology | Tanon-5200 |
| TG含量测定 | WD-2012B自动酶标仪 | Liuyi Biotechnology | WD-2012B |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本检测 | CAD患者入组标准依据WHO 1979年标准;对照组经冠状动脉造影或CTA排除冠心病;外周血采集后2小时内提取RNA和蛋白。 阅读提示:见Methods 2.1, 2.3.1 |
| 细胞培养与转染 | L-02细胞培养条件(37°C, 5% CO2, 89% RPMI-1640, 10% FBS, 1% PS);转染时细胞密度约70%;转染试剂和siRNA用量(5μL Lipo3000, 12.5μL siRNA);转染后48小时提取RNA/蛋白。 阅读提示:见Methods 2.3.2 |
| RT-PCR | RNA质量要求(28S:18S=2:1, OD260/280=1.9-2.1);反转录RNA量1μg;PCR条件(95°C 10min; 40个循环: 95°C 10s, 58°C 30s, 72°C 30s)。 阅读提示:见Methods 2.3.3及表2 |
| Western blot | SDS-PAGE上样量30μg;转膜条件(300mA, 90min);封闭条件(室温1h);一抗浓度和来源(如TBL1XR1 1:1000, PPARα 1:1000)。 阅读提示:见Methods 2.3.4 |
| TG含量测定 | 细胞分组(空白对照、模型、阴性对照、siRNA-258);50% FBS处理48小时;超声破碎条件(300W, 3-5s, 间隔30s, 重复4次);测定波长562nm。 阅读提示:见Methods 2.3.5 |
| 统计分析 | 正态资料用均数±标准差,t检验或单因素方差分析;非正态资料用秩和检验;分类资料用χ2检验;Logistic回归和Spearman相关分析。 阅读提示:见Methods 2.3.6 |