构建重组r-LAB菌株
获得稳定表达猪IFITM3蛋白的重组植物乳杆菌。
从猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）提取RNA，反转录cDNA，PCR扩增带有FLAG和His标签的IFITM3基因，克隆至pMG36e载体，电转化至CICC6240菌株。
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表达IFITM3的植物乳杆菌（HA-r-LAB）作为靶向TGEV免疫治疗的益生菌载体
IFITM3-expressing Lactobacillus plantarum (HA-r-LAB) as a probiotic vector for targeted immunotherapy against TGEV.
实验完整度
高包含体外细胞实验（Co-IP、Western blot、RNA-seq）、模拟胃肠道耐受实验、小鼠肠道定殖实验和仔猪攻毒模型，涵盖分子互作、功能验证和体内保护效果评估。
主要模型
仔猪TGEV感染模型 小鼠肠道定殖模型 293FT细胞（用于Co-IP和Western blot） PK15细胞（用于RNA-seq）
重点核对
仔猪分组及给药方案：PBS、CICC6240、HA-r-LAB，每日一次，连续3天，第4天TGEV攻毒 TGEV攻毒剂量：10 mL，TCID50=10^8/mL TGEV病毒载量检测：qPCR，标准质粒R²=0.996 IFITM3与TGEV-N蛋白互作验证：Co-IP，使用anti-Flag和anti-HA抗体 RNA-seq样本：PK15细胞转染TGEV-N质粒，48小时收集RNA
摘要
植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）因其强大的益生菌功能和先进的药物递送能力，已成为异源表达生物活性治疗性蛋白质的多功能平台。在本研究中，我们通过基因工程改造植物乳杆菌，使其表达干扰素诱导跨膜蛋白3（IFITM3），这是一种免疫调节蛋白，主要通过阻断病毒进入而表现出广泛的抗病毒功效。为了增强胃肠道耐受性和全身生物利用度，通过精确的纳米封装方法将重组菌株用透明质酸（HA-r-LAB）封装，形成稳定的纳米颗粒样结构。在以典型冠状病毒——传染性胃肠炎病毒（TGEV）攻毒的仔猪模型中，口服表达IFITM3的HA-r-LAB可显著降低病毒滴度并缓解临床症状。此外，生化分析证实IFITM3与TGEV核衣壳（N）蛋白之间存在直接分子相互作用，提示一种前所未有的抗病毒机制。这些发现强调了HA-r-LAB作为基于益生菌的抗病毒蛋白纳米递送载体的潜力，并为开发针对冠状病毒的组合治疗策略奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在评估透明质酸封装的重组植物乳杆菌（HA-r-LAB）递送IFITM3蛋白对TGEV感染的抗病毒效果及其分子机制。
- 核心机制
- IFITM3通过直接与TGEV核衣壳（N）蛋白相互作用，阻断病毒进入宿主细胞，从而抑制病毒感染。
- 主要证据
- 在仔猪模型中，HA-r-LAB口服给药显著降低病毒载量、减轻临床症状和肠道病理损伤，并抑制炎症因子表达；Co-IP实验证实IFITM3与TGEV-N蛋白的相互作用。
- 研究意义
- 研究为开发基于益生菌的抗病毒蛋白递送系统提供了基础，并为针对冠状病毒的组合治疗策略提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HA封装制备HA-r-LAB
通过透明质酸封装提高r-LAB的胃肠道存活率和递送效率。
将重组菌悬浮于0.5%透明质酸钠溶液，室温孵育30分钟，离心洗涤三次，获得HA-r-LAB复合物。
体外特性表征
评估HA封装对细菌生长、存活和胃肠道耐受性的影响。
测定生长曲线（OD600）、在不同温度下的生长、质粒稳定性，以及模拟胃液和肠液处理后的存活率。
小鼠肠道定殖实验
比较HA-r-LAB与未封装菌株在肠道中的定殖能力。
将CICC6240或HA-r-LAB口服给予昆明小鼠，24-48小时后处死，取十二指肠、空肠和回肠，匀浆涂板计数CFU。
仔猪TGEV攻毒实验
在猪体内评估HA-r-LAB对TGEV感染的保护效果。
一周龄仔猪随机分组，分别口服PBS、CICC6240或HA-r-LAB，连续3天，第4天攻毒TGEV，观察临床症状、存活率、体重变化，并采集组织样本分析。
组织病理学和病毒载量分析
评估HA-r-LAB对肠道病理损伤和病毒复制的影响。
采集肠道组织进行H&E染色和病理评分；利用qPCR检测各肠段病毒载量和炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）转录水平。
分子相互作用验证
验证IFITM3与TGEV核衣壳（N）蛋白之间的直接相互作用。
用AlphaFold3预测结构，进行蛋白-蛋白对接，并通过免疫共沉淀（Co-IP）实验验证。
转录组分析（RNA-seq）
探讨TGEV-N蛋白对宿主基因表达的影响。
在PK15细胞中转染TGEV-N质粒，48小时后提取RNA，构建文库进行测序，并进行GO、KEGG通路和共表达网络分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 构建r-LAB | TRIzol试剂 | TransGen | -- |
| pMG36e质粒 | -- | -- | |
| HA封装 | 透明质酸钠 | -- | -- |
| 细胞培养与转染 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| 分子互作验证 | 抗Flag抗体 | Abcam | -- |
| 抗HA抗体 | Elabscience | -- | |
| 蛋白提取与Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| Western blot检测 | ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- |
| RNA-seq | RNA Nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| AMPure XP系统 | Beckman Coulter | -- | |
| r-LAB诱导 | 乳链菌肽 | MCE | -- |
| r-LAB裂解 | 溶菌酶 | Solarbio | -- |
| RNA提取 | 动物组织DNA提取试剂盒 | TianGen | -- |
| qPCR | SYBR Green预混液 | Vazyme | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 构建r-LAB | 宿主菌株CICC6240、表达质粒pMG36e、IFITM3基因序列（含FLAG和His标签）、电转化参数 阅读提示：参见“Construction of r-LAB”和“Table 1”中引物序列 |
| HA封装 | 透明质酸钠分子量（5 kDa）、浓度（0.5%）、包被时间（30分钟）、离心洗涤次数（3次） 阅读提示：参见“Construction of HA-r-LAB” |
| 模拟胃肠液耐受实验 | SGF组成（胃蛋白酶0.32 mg/mL、NaCl 0.9%、pH 2.0）、SIF组成（胰酶1 mg/mL、胆盐3 mM、pH 7.4）、处理时间（SGF 1h、SIF 2h） 阅读提示：参见“Simulated gastrointestinal fluid tolerance assay” |
| 肠道定殖实验 | 小鼠品系（昆明小鼠，SPF级）、灌胃剂量、取样时间（24-48小时）、检测组织（十二指肠、空肠、回肠） 阅读提示：参见“Intestinal colonization assay” |
| 仔猪攻毒实验 | 仔猪日龄（1周龄）、分组（PBS、CICC6240、HA-r-LAB）、给药剂量（200 µL）、给药天数（3天）、TGEV攻毒剂量（10 mL，TCID50=10^8/mL）、观察时间（至第12天） 阅读提示：参见“Piglet challenge experiment”和“Figure 3A”中的时间线 |
| 病毒载量和细胞因子检测 | 组织类型（胃、十二指肠、空肠、回肠）、qPCR标准质粒R²、内参基因（GAPDH）、引物序列（Table 1）、炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α） 阅读提示：参见“RNA extraction and qPCR”和“Table 1” |
| 分子相互作用验证 | 细胞系（293FT）、转染质粒（TGEV-N、IFITM3）、抗体（anti-Flag、anti-HA）、Co-IP步骤 阅读提示：参见“Coimmunoprecipitation (Co-IP) assays and western blotting analyses” |
| RNA-seq | 细胞系（PK15）、转染质粒（TGEV-N）、RNA提取时间（48小时）、文库构建方法（AMPure XP）、测序平台信息未明确 阅读提示：参见“Data analysis of RNA-Seq” |