表面展示载体构建与酵母转化
构建用于在酵母细胞表面展示VP1融合蛋白的表达载体并转化酵母。
通过重叠延伸PCR构建了融合基因（Ramy1A-Co1-20aaC VP3-VP1-AGA1-C320），克隆至pYEGPD-TER载体，转化酿酒酵母2805，并通过尿嘧啶缺陷筛选、菌落PCR和测序验证。
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口蹄疫病毒VP1在酿酒酵母细胞表面的展示
Cell surface display of VP1 of foot-and-mouth disease virus on Saccharomyces cerevisiae.
实验完整度
中包含表面展示构建、细胞壁表达验证（Western blot、荧光显微镜）及小鼠口服免疫实验，但主要是免疫应答初步评估，缺乏攻毒保护等体内功能验证。
主要模型
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 2805菌株 BALB/c小鼠
重点核对
表面展示构建体pYESDVP1包含Ramy1A信号肽、Co1配体、VP1及AGA1-C320锚定序列 酵母培养条件：30°C培养3天用于小鼠喂养 口服免疫剂量：每只小鼠每次1.6克酵母细胞，重悬于2毫升PBS，分四次灌胃，在0、14、28天进行 小鼠分组：每组5只，包括表面展示组、细胞内表达组和阴性对照组
摘要
背景：口蹄疫是一种主要影响偶蹄动物的高度传染性疾病。该疾病的快速传播阻碍了控制措施的成功实施。这迫切需要开发一种疫苗以确保受影响动物的安全饲养。然而，传统疫苗存在一些缺点，包括对持续感染的部分保护以及缺乏对不同毒株的交叉保护。结果：我们开发了一种针对VP1的口服疫苗，VP1是口蹄疫病毒的主要免疫原性蛋白。我们使用表面展示方法表达了这种蛋白质，并随后分析了其免疫效果。Western blot分析和共聚焦成像证实了我们的构建体在酵母细胞表面有效表达了VP1。然而，表面展示的VP1的表达水平明显低于细胞内VP1。喂食表达表面展示VP1的细胞的小鼠的免疫反应高于喂食等量表达细胞内VP1的细胞的小鼠。结论：我们的研究表明，酵母表面表达的VP1比细胞内表达的VP1更能引发针对口蹄疫病毒的优越免疫反应，这可能为提供简单高效的口服疫苗带来潜在突破。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在酿酒酵母细胞表面展示口蹄疫病毒VP1融合蛋白是否能诱导比细胞内表达更好的免疫反应，以作为口服疫苗候选。
- 核心机制
- 将VP1融合蛋白锚定在酵母细胞表面（通过AGA1-C320），增强抗原呈递，从而更有效地激发全身性IgG免疫反应。
- 主要证据
- Western blot和免疫荧光证实VP1锚定在细胞壁；小鼠口服表面展示VP1的酵母细胞后，其血清IgG水平显著高于细胞内表达组和对照组（13天和21天）。
- 研究意义
- 酵母表面展示VP1提供了一种潜在的口服疫苗策略，可能为开发简单高效的口服口蹄疫疫苗提供突破。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录水平分析
筛选高表达目标基因转录本的转化子。
提取总RNA，进行Northern blot分析，选择高转录水平的表面展示转化子（TpYESDVP1-6, 10, 16, 17）和一个细胞内表达转化子（TpYENSDVP1-8）。
蛋白表达验证
验证VP1融合蛋白在酵母细胞表面的展示及表达水平。
提取细胞总可溶蛋白、细胞壁和培养滤液，通过Western blot检测VP1蛋白，观察到细胞壁部分有约64kDa的条带。
免疫荧光定位
可视化确认VP1蛋白在酵母细胞表面的定位。
对重组酵母进行免疫染色，使用FITC标记的二抗，共聚焦显微镜观察荧光信号。
口服免疫小鼠
评估表面展示VP1酵母口服接种后的全身和黏膜免疫反应。
6周龄BALB/c小鼠分成三组（每组5只），在0、14、28天口服酵母细胞，在13、49、66天收集血和粪便样本，检测IgG和IgA抗体。
长期记忆反应评估
评估口服免疫后是否产生长期记忆反应。
在末次免疫后3周进行腹膜内注射20μg大肠杆菌表达的VP1加强免疫，3天后收集血和粪便检测抗体。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子克隆 | pGEM-T Easy载体 | Promega | -- |
| 酵母培养 | YPAD培养基 | -- | -- |
| 酵母转化 | 醋酸锂 | -- | -- |
| Northern blot | Amersham Hybond™膜 | GE Healthcare | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素滤膜(Hybond™) | Amersham Biosciences | -- |
| 兔抗FMDV VP1多克隆抗体 | Biorbyt | orb499995 | |
| 山羊抗兔IgG碱性磷酸酶偶联物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫荧光 | FITC标记的山羊抗兔IgG (H+L) | Elabscience | E-AB-1014 |
| 共聚焦激光扫描显微镜(FV3000) | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 酵母表达培养 | 培养温度，培养时间，表达水平 阅读提示：见 'Protein extraction and Western blot analysis' 部分及结果部分 'Temporal expression' |
| 表面展示验证 | 细胞壁分离方法，Western blot检测条件 阅读提示：见 'Protein extraction and Western blot analysis' 部分 |
| 免疫荧光 | 抗体浓度，孵育时间，洗涤次数 阅读提示：见 'Immunostaining and fluorescence microscopy' 部分 |
| 口服免疫 | 小鼠品系，周龄，免疫剂量，灌胃体积，时间间隔，分组，样本量 阅读提示：见 'Oral immunization of mice' 部分及图4图注 |
| 长期记忆反应 | 加强免疫剂量，途径，时间点 阅读提示：见 'Oral immunization of mice' 部分最后一段 |