纳米泡制备与表征
制备并表征载有HMME的纳米泡（HMME@NBs），评估其理化性质、稳定性和药物负载效率。
采用薄膜水化-声震法制备HMME@NBs，通过光学显微镜、CLSM、TEM、DLS、UV-vis等表征其形态、粒径、电位、包封率、载药率及稳定性。
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代谢组与转录组的比较分析探索声动力疗法联合氯尼达明对肝细胞癌的抑制作用
Comparative analysis of metabolome and transcriptomes to explore the inhibited influence of sonodynamic therapy combined with lonidamine on hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含纳米泡制备与表征、细胞摄取、细胞毒性、ROS检测、凋亡、迁移、动物模型、免疫组化、转录组、代谢组及整合分析等多层级验证，并有Western blot和GSH检测等机制验证。
主要模型
HepG2细胞 Huh7细胞 BALB/c裸鼠皮下HepG2异种移植瘤模型
重点核对
HMME@NBs的粒径、电位、包封率及稳定性 细胞实验分组：PBS对照、LND（15 μg/mL）、HMME@NBs（10 μg/mL）+SDT、联合组 超声参数：1 MHz，50%占空比，1.0 W/cm²，60秒（体外） 动物实验分组：PBS对照、LND（15 mg/kg）、HMME@NBs（10 mg/kg）+SDT、联合组 体内超声照射：2 W/cm²，60秒，注射后4小时
摘要
声动力疗法（SDT）已成为治疗肝细胞癌（HCC）的一种有前景的方法，其通过将声敏剂与低强度超声相结合。然而，单独的SDT无法取得令人满意的效果。在此，我们开发了负载血卟啉单甲醚（HMME@NBs）的新型纳米泡，并评估了其与糖酵解抑制剂氯尼达明（LND）联合对HCC的治疗潜力。HMME@NBs成功制备，粒径为410.58±20.07 nm，zeta电位为-8.38±1.12 mV。HMME的包封率和载药率分别为80.6%和7.12%。体外和体内研究均表明，虽然SDT和LND单药治疗可抑制HepG2细胞和裸鼠异种移植瘤的生长，但联合治疗表现出最显著的抑制作用。对肿瘤组织的多组学分析揭示了代谢物和基因表达的显著改变，其中谷胱甘肽代谢等关键通路与治疗反应相关。我们的研究结果强调了HMME@NBs介导的SDT联合LND的增强抗肿瘤疗效，并得到了转录组学和代谢组学分析的机制见解支持。这种协同策略对HCC治疗具有巨大潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 声动力疗法联合氯尼达明是否能协同抑制肝细胞癌的生长，其潜在的分子机制是什么？
- 核心机制
- 声动力疗法和氯尼达明通过诱导凋亡（上调促凋亡蛋白HRK，下调抗凋亡蛋白ARC）、破坏线粒体功能、增加ROS产生及下调谷胱甘肽（GSH）水平，协同抑制HCC生长。
- 主要证据
- 体外CCK-8和凋亡实验显示联合治疗显著降低细胞活力并诱导凋亡；体内异种移植瘤模型显示联合治疗显著抑制肿瘤生长并降低Ki67表达；转录组和代谢组整合分析显示谷胱甘肽代谢和癌症中心碳代谢通路显著富集，且GSH水平下降。
- 研究意义
- 该研究为声动力疗法联合氯尼达明的协同抗肿瘤策略提供了机制依据，并提示谷胱甘肽代谢等通路相关生物标志物可作为HCC精准治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞摄取与细胞毒性
评估HMME@NBs的细胞摄取效率以及不同超声强度和药物浓度下的细胞毒性，确定后续实验参数。
HepG2和Huh7细胞与PBS、游离HMME、HMME@NBs孵育，通过CLSM和流式定量摄取；CCK-8法评估不同超声强度、药物浓度及HMME@NBs联合超声的细胞毒性。
体外联合治疗效应验证
验证SDT联合LND对HCC细胞活力、凋亡、ROS产生和迁移能力的影响。
将细胞分为A（PBS）、B（LND）、C（HMME@NBs+SDT）、D（联合）四组处理，通过CCK-8检测细胞活力，Annexin V-FITC/PI流式检测凋亡，DCFH-DA检测ROS，Transwell实验检测迁移。
体内分布与抗肿瘤疗效评估
评估HMME@NBs在体内的分布、代谢以及SDT联合LND对HCC异种移植瘤生长的抑制作用。
建立BALB/c裸鼠皮下HepG2移植瘤模型，荧光成像观察HMME@NBs分布；将荷瘤鼠随机分为四组并进行治疗，测量肿瘤体积、体重，H&E染色和Ki67免疫组化评估肿瘤抑制。
转录组学与代谢组学分析
通过转录组和代谢组分析，揭示SDT联合LND治疗HCC的分子机制及关键通路。
从各组肿瘤组织提取RNA进行RNA-seq，使用LC-MS/MS进行非靶向代谢组学分析，并分别进行差异表达基因和差异代谢物鉴定、功能富集分析以及整合分析。
关键分子验证
验证转录组和代谢组分析发现的差异基因和代谢物，如HRK、ARC和GSH水平。
Western blot检测HRK和ARC蛋白表达，GSH检测试剂盒测定GSH水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 纳米泡制备 | 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids | -- |
| 牙科汞合金搅拌器 | YJT Medical Apparatuses and Instruments | -- | |
| 纳米泡表征 | 光学显微镜 | Nikon | -- |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | ZEISS LSM980 | -- | |
| 透射电子显微镜 | Hitachi HT 7800 | -- | |
| Zetasizer Nano ZS90 粒度仪 | Malvern Instruments | -- | |
| 紫外-可见分光光度计 | Thermo Evolution 201 | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| 细胞摄取 | Hoechst 33342染料 | Beyotime | -- |
| 流式细胞仪 | BD FACSAria III | -- | |
| 体外超声处理 | 超声换能器 | Institute of Ultrasound Imaging, Chongqing Medical Sciences | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | Beyotime | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI检测试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning Costar | -- |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| 小动物成像 | Xenogen IVIS成像系统 | Caliper Life Sciences | -- |
| 血液分析 | Pointcare M3 血液分析仪 | MNCHIP | -- |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| HRP标记二抗 | Abcam | ab6721 | |
| RNA-seq | RNA Nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| Qubit 2.0荧光计 | -- | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 代谢组学 | Q Exactive™ HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blotting | 抗HRK抗体 | Abcam | ab45419 |
| 抗ARC抗体 | Proteintech | 10846-2-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab9485 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG (H+L) | Abcam | ab205718 | |
| ECL底物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| X射线胶片 | Fujifilm | -- | |
| GSH检测 | 还原型谷胱甘肽比色检测试剂盒 | Elabscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 纳米泡制备与表征 | 脂质组成及比例、溶剂、薄膜水化温度、挤出次数和膜孔径、气体类型、振荡参数、表征方法（DLS测量稀释倍数、温度、时间） 阅读提示：Methods 2.1节及Figure 1 |
| 细胞培养 | 细胞系（HepG2、Huh7）来源、培养基、血清浓度、抗生素浓度、培养条件（温度、CO₂） 阅读提示：Methods 2.2节 |
| 体外细胞摄取 | 细胞接种密度、培养时间、HMME浓度、孵育时间、染色时间、荧光定量方法 阅读提示：Methods 2.3节及Figure 2A-B |
| 体外细胞毒性及联合治疗 | 细胞接种密度、超声参数（频率、强度、时间、占空比）、药物浓度（LND、HMME@NBs）、分组处理、孵育时间 阅读提示：Methods 2.4节及Figure 2C-F |
| 体内动物实验 | 动物品系、年龄、体重、饲养条件、肿瘤细胞接种数量、分组、给药途径和剂量（LND 15 mg/kg，HMME@NBs 10 mg/kg）、超声照射参数（2 W/cm²，60秒）、肿瘤体积测量方法 阅读提示：Methods 2.8和2.10节及Figure 3A-D |
| 转录组学分析 | 样本数量（每组3个）、RNA提取方法、文库构建、测序平台、差异表达基因阈值（padj≤0.05，|log2FC|≥1）、富集分析工具 阅读提示：Methods 2.13节及Results 3.9节 |
| 代谢组学分析 | 样本数量（每组6个）、样本制备方法（称量、溶剂）、色谱质谱条件、差异代谢物筛选阈值（VIP>1，p<0.05，|log2FC|≥1） 阅读提示：Methods 2.13节及Results 3.10节 |
| Western blotting | 蛋白提取方法、抗体信息（HRK、ARC、GAPDH）及稀释比例、二抗、显色方法 阅读提示：Methods 2.14节及Figure S15 |
| GSH检测 | 试剂盒品牌、样品处理、离心条件、检测波长 阅读提示：Methods 2.15节及Figure S16 |