生物信息学分析和模型构建
利用公共数据库和机器学习识别与前列腺癌进展相关的二硫化物凋亡相关基因，构建诊断模型，筛选关键基因SLC7A11。
整合TCGA-PRAD、GSE70770和GSE21032数据集，采用10种机器学习算法和111种组合构建预测模型，筛选出包含SLC7A11在内的15个基因，并进行差异表达、生存分析、功能富集和相关性分析。
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超级增强子通过FOXA1介导SLC7A11调控前列腺癌中的二硫化物凋亡
Super-enhancers mediates SLC7A11 via FOXA1 to regulate disulfidptosis in prostate cancer.
实验完整度
高包含生物信息学分析、细胞实验、动物模型、CUT&Tag、ChIP-seq、CRISPR-Cas9敲除及代谢组学等多层级验证。
主要模型
前列腺癌细胞系PC-3 DU145 前列腺上皮细胞RWPE-1 裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
SLC7A11在PC-3和DU145细胞中的过表达和敲除效率（Western blot验证） 葡萄糖剥夺条件下SLC7A11过表达诱导细胞凋亡和细胞骨架塌陷 BAY-876抑制SLC7A11高表达肿瘤生长的体内剂量（3 mg/kg，腹腔注射，每3天一次） FOXA1作为SLC7A11启动子转录调控因子的结合位点（TFBS1和TFBS2） CRISPR-Cas9介导的FOXA1超增强子区域（chr14:37583488–37589585）删除对FOXA1和SLC7A11表达的影响
摘要
前列腺癌（PCa）由于异常的雄激素受体信号传导和重塑的肿瘤微环境，仍然是一个主要的治疗挑战。二硫化物凋亡（disulfidptosis）是一种最近发现的细胞死亡形式，其特征是在葡萄糖剥夺和高SLC7A11表达条件下细胞骨架塌陷，为干预提供了潜在的新途径。在本研究中，我们整合了TCGA和GEO数据，并采用机器学习技术来识别前列腺癌中与二硫化物凋亡相关的基因。使用SLC7A11过表达和敲除细胞系的功能分析表明，SLC7A11促进细胞增殖、迁移和侵袭，而其过表达在葡萄糖饥饿条件下触发二硫化物凋亡，也可通过葡萄糖摄取抑制剂BAY-876药理学诱导。通过CUT&Tag、ChIP-seq和荧光素酶实验，我们确定了FOXA1是SLC7A11的关键转录调控因子，由位于chr14:37583488–37589585的超增强子驱动。CRISPR-Cas9删除该超增强子降低了FOXA1和SLC7A11的表达，从而保护细胞免受二硫化物凋亡。这些发现强调了SE/FOXA1/SLC7A11调控轴在驱动二硫化物凋亡和肿瘤进展中的关键作用，表明靶向该通路，特别是在葡萄糖剥夺的肿瘤微环境中，可能为PCa提供有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SLC7A11在前列腺癌中如何受超增强子调控，以及这种调控如何影响二硫化物凋亡和肿瘤进展？
- 核心机制
- 超增强子（SE）位于chr14:37583488–37589585，通过转录因子FOXA1调控SLC7A11表达，在葡萄糖剥夺条件下，高SLC7A11表达导致NADPH耗竭和细胞骨架蛋白异常二硫键形成，从而触发二硫化物凋亡。
- 主要证据
- 通过CUT&Tag和ChIP-seq鉴定SE并验证FOXA1结合，双荧光素酶报告实验证实FOXA1激活SLC7A11启动子，CRISPR-Cas9删除SE降低FOXA1和SLC7A11表达并抑制二硫化物凋亡，BAY-876抑制SLC7A11高表达异种移植瘤的生长。
- 研究意义
- 本研究揭示了SE/FOXA1/SLC7A11调控轴在前列腺癌二硫化物凋亡和肿瘤进展中的作用，为靶向该通路（特别是在葡萄糖剥夺的肿瘤微环境中）提供了治疗策略，并为开发新型靶向治疗提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SLC7A11对细胞功能的影响
验证SLC7A11对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和体内肿瘤生长的影响。
在PC-3和DU145细胞中过表达和敲除SLC7A11，通过伤口愈合、Transwell实验和异种移植瘤模型评估细胞迁移、侵袭和肿瘤生长。
葡萄糖剥夺条件下的细胞死亡和细胞骨架分析
探究SLC7A11在葡萄糖剥夺条件下是否诱导二硫化物凋亡，并观察细胞骨架变化。
在葡萄糖存在或缺失条件下培养PC-3和DU145细胞，通过流式细胞术检测凋亡，通过F-actin染色观察细胞骨架形态。
鉴定SLC7A11的转录调控因子FOXA1
筛选并验证SLC7A11上游转录因子，并研究其调控机制。
通过数据库预测和转录组测序，筛选出候选转录因子FOXA1，并通过双荧光素酶报告实验、CUT&Tag-qPCR验证FOXA1结合SLC7A11启动子。
识别和验证FOXA1相关超级增强子
利用表观遗传学数据鉴定调控FOXA1的超级增强子，并验证其功能。
基于H3K27ac ChIP-seq和CUT&Tag数据，通过ROSE算法识别超增强子，并设计CRISPR sgRNA靶向SE区域，评估对FOXA1和SLC7A11表达的影响。
BAY-876体内外干预实验
评估葡萄糖转运抑制剂BAY-876对SLC7A11高表达肿瘤的抑制作用。
在体外检测BAY-876对葡萄糖摄取和NADPH的影响，并在异种移植瘤模型中给予BAY-876，评估肿瘤生长、增殖和细胞死亡标志物。
代谢组学和氧化还原状态分析
探究SLC7A11调控对代谢和氧化还原稳态的影响，以及FOXA1-SE缺失的效应。
对SLC7A11敲除细胞进行靶向代谢组学，检测相关代谢物和通路；在过表达和SE缺失细胞中检测NADP⁺/NADPH、GSH、半胱氨酸水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | SLC7A11抗体 | PROTEINTECH GROUP, INC | 26864-1-AP |
| FOXA1抗体 | Immunoway | YT5324 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 葡萄糖剥夺处理 | 无糖RPMI-1640培养基 | MeilunBio | MA0555 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/7-AAD凋亡检测试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 40311ES20 |
| 半胱氨酸摄取检测 | 半胱氨酸摄取荧光检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-F066 |
| NADP+/NADPH检测 | NADP⁺/NADPH比色分析试剂盒 | Elabscience | E-BC-K803-M |
| GSH检测 | 谷胱甘肽ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0026 |
| 非还原性电泳 | 蓝色/透明非变性PAGE试剂盒 | MeilunBio | MA0472 |
| G6PDH活性检测 | G6PDH活性检测试剂盒 | Beyotime | S0189 |
| G6P活性检测 | G6P活性检测试剂盒 | Beyotime | S0185 |
| 药物处理 | I-BET151 | ApexBio | B1500 |
| JQ-1 | ApexBio | A1910 | |
| BAY-876 | MedChemExpress | HY-100017 | |
| CRISPR-Cas9敲除 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | 52961 |
| 基因编辑 | CRISPR-Cas9 | -- | -- |
| 细胞培养 | 基质胶 | -- | -- |
| 动物实验 | BAY-876 | MedChemExpress | HY-100017 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（PC-3、DU145、RWPE-1等），培养基（RPMI-1640、10% FBS、1%青霉素-链霉素），培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：参见Materials and methods中的Cell lines and culture |
| 基因敲除/过表达 | 慢病毒和CRISPR转导方法，SLC7A11过表达和敲除效率验证，SE-sgRNA和Pr-sgRNA的设计序列及靶向位置 阅读提示：参见Materials and methods中的CRISPR-Cas9 knockout和结果第2节 |
| 药物处理 | iBET-151和JQ-1的处理浓度（PC-3:145µM和0.5µM；DU145:65µM和0.4µM），BAY-876的浓度（体外IC50和体内3mg/kg），处理时间 阅读提示：参见Materials and methods中的In vivo drug intervention和Results中iBET-151和BAY-876相关小节 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/7-AAD染色流程，流式细胞仪获取事件数（至少10000），葡萄糖剥夺时间（24小时） 阅读提示：参见Materials and methods中的Flow cytometry和结果第2节 |
| 蛋白表达检测 | Western blot抗体（SLC7A11和FOXA1）的稀释比例（未明确说明），BCA定量，SDS-PAGE和电转条件 阅读提示：参见Materials and methods中的Western blotting |
| 基因表达检测 | qRT-PCR引物序列和退火温度（补充文件），RNA提取方法（TRIzol），内参基因 阅读提示：参见Materials and methods中的qRT-PCR和补充文件 |
| 体内肿瘤模型 | 裸鼠品系和来源（未明确），注射细胞数（3×10^7或5×10^7），基质胶比例（1:1:3），给药频率（每3天），肿瘤测量时间 阅读提示：参见Materials and methods中的Xenograft Model和In vivo drug intervention |
| 表观遗传学实验 | CUT&Tag和ChIP-seq的抗体（H3K27ac和FOXA1），细胞固定条件（0.1%甲醛），测序平台（NovaSeq 6000），数据分析参数 阅读提示：参见Materials and methods中的ChIP-seq analysis和CUT&Tag sequencing |
| 代谢物检测 | 代谢组学平台（UPLC-MS/MS），覆盖代谢物列表（106种），样本处理（预冷甲醇-水提取），差异代谢物筛选标准（FC>1或<1, p<0.05, VIP≥1） 阅读提示：参见Materials and methods中的Targeted metabolomics sequencing |
| 统计方法 | 统计软件（SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0），t检验或ANOVA的使用条件，显著性水平（P<0.05） 阅读提示：参见Materials and methods中的Statistical analysis |