建立仑伐替尼耐药细胞模型并评估有氧糖酵解
验证LR细胞中糖酵解是否增强，并筛选关键基因。
通过逐步增加仑伐替尼浓度建立耐药Huh7和Hep3B细胞系，检测IC50、凋亡、ATP水平、葡萄糖摄取、乳酸产生和ECAR。分析GSE211850数据，筛选AKR家族基因表达差异。
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AARS1介导的AKR1B10乳酸化稳定有氧糖酵解正反馈环路，驱动肝细胞癌仑伐替尼耐药
AARS1-mediated AKR1B10 lactylation stabilizes an aerobic glycolysis-positive feedback loop to drive lenvatinib resistance in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞系功能实验（CCK-8、流式、Seahorse）、机制验证（CoIP、质谱、WB、CHX、泛素化）以及体内动物模型（CDX和PDX）和临床样本分析（IHC），多层级验证。
主要模型
Huh7肝癌细胞系及仑伐替尼耐药株 Hep3B肝癌细胞系及仑伐替尼耐药株 Hepa1-6小鼠肝癌细胞及耐药株 BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠皮下异种移植瘤模型 患者来源异种移植（PDX）模型 临床肝癌组织样本（161例）
重点核对
肝癌细胞系来源及仑伐替尼耐药株的建立（IC50验证） AKR1B10 K173乳酸化位点及其功能（K173R突变体） AARS1作为乳酸转移酶的功能（AARS1-5M突变体） LDHA Y10磷酸化及LDHA的转录调控（H3K18la ChIP-qPCR） 体内模型中EPA与仑伐替尼联合用药的剂量和给药方案
摘要
背景：仑伐替尼耐药（LR）是肝细胞癌（HCC）治疗中的重大障碍。醛酮还原酶家族1成员B10（AKR1B10）参与肿瘤代谢重编程；然而，其在LR中的作用仍不清楚。方法：整合公共数据库的生物信息学分析，并在建立的LR HCC细胞系中进行了验证。进行了功能测定（CCK‐8、流式细胞术和Seahorse XF分析），以评估增殖、凋亡和有氧糖酵解。使用免疫共沉淀、质谱和蛋白质印迹对AKR1B10的翻译后修饰进行了表征。结果：AKR1B10被确定为通过建立代谢正反馈环路驱动耐药的关键因子。生物信息学分析和实验验证表明，AKR1B10上调与治疗耐药相关。功能研究表明，AKR1B10通过增强有氧糖酵解促进耐药。机制上，丙氨酰tRNA合成酶1介导AKR1B10赖氨酸173（K173）位点的乳酸化修饰，通过阻断泛素（Ub）‐蛋白酶体降解来稳定AKR1B10。稳定的AKR1B10与乳酸脱氢酶A（LDHA）物理相互作用，促进LDHA Y10位点磷酸化，并加速糖酵解乳酸产生。增加的乳酸随后诱导组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la），转录上调LDHA表达。因此，形成了一个自我强化的AKR1B10–乳酸–LDHA扩增环路。临床分析证实，在LR HCC患者组织中AKR1B10表达升高。重要的是，用AKR1B10抑制剂依帕司他（EPA）靶向该轴与仑伐替尼协同作用，在异种移植小鼠模型和患者来源异种移植模型中克服耐药。结论：这些发现将AKR1B10确立为HCC中的生物标志物和治疗靶点。它们揭示了一种新的乳酸化驱动的糖酵解适应机制，并支持EPA–仑伐替尼联合治疗的临床转化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AKR1B10在肝细胞癌仑伐替尼耐药中的作用及潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- AARS1介导的AKR1B10 K173乳酸化通过阻断泛素-蛋白酶体降解稳定AKR1B10，稳定后的AKR1B10促进LDHA Y10磷酸化并增加乳酸产生，乳酸进一步诱导H3K18la介导的LDHA转录上调，形成自增强的AKR1B10-乳酸-LDHA正反馈环路，驱动有氧糖酵解和仑伐替尼耐药。
- 主要证据
- 体外实验（CCK-8、流式细胞术、Seahorse）显示AKR1B10增强有氧糖酵解并赋予耐药；CoIP和质谱证实AARS1催化K173乳酸化，且K173R突变消除乳酸化并降低蛋白稳定性；泛素化实验表明乳酸化抑制K63连接的多聚泛素化；LDHA Y10磷酸化实验和ChIP-qPCR证明H3K18la富集于LDHA启动子；体内异种移植模型和PDX模型证实EPA与仑伐替尼联合可克服耐药。
- 研究意义
- 该研究将AKR1B10确立为HCC的生物标志物和治疗靶点，揭示了乳酸化驱动的糖酵解适应新机制，并支持EPA-仑伐替尼联合治疗的临床转化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证AKR1B10对耐药和糖酵解的功能影响
探究AKR1B10是否通过调控有氧糖酵解影响仑伐替尼耐药。
在LR细胞中敲低AKR1B10，在亲本细胞中过表达AKR1B10，检测IC50、凋亡、ATP、葡萄糖、乳酸和ECAR。使用2-DG和鱼藤酮分别抑制和激活糖酵解，观察对耐药性的影响。
鉴定AKR1B10乳酸化修饰及功能
确定AKR1B10是否发生乳酸化，并评估乳酸化对其蛋白表达和耐药的影响。
通过质谱鉴定乳酸化位点，构建K173R突变体，检测乳酸化水平、蛋白稳定性、IC50和凋亡。使用Nala处理观察乳酸化增强。
验证AARS1作为乳酸转移酶的作用
确认AARS1是否直接与AKR1B10相互作用并催化其乳酸化。
通过CoIP验证AARS1与AKR1B10的相互作用，过表达或敲低AARS1观察AKR1B10乳酸化水平，检测AARS1-5M突变体是否影响乳酸化，通过分子对接预测结合界面并验证。
阐明乳酸化抑制AKR1B10泛素化降解
明确乳酸化是否通过影响泛素化调控AKR1B10蛋白稳定性。
使用MG132、CHX追踪实验检测AKR1B10蛋白稳定性。通过泛素化实验检测K173R突变体和AARS1对AKR1B10泛素化水平的影响，并区分泛素连接类型（K6、K29、K48、K63）。
验证AKR1B10对LDHA磷酸化及转录的影响
研究AKR1B10是否通过促进LDHA Y10磷酸化及上调LDHA表达来增强糖酵解。
通过CoIP和免疫荧光验证AKR1B10与LDHA的相互作用。检测AKR1B10过表达或敲低对LDHA Y10磷酸化和LDHA mRNA的影响。通过ChIP-qPCR检测LDHA启动子区域的H3K18la富集。
评估LDHA Y10磷酸化在耐药中的必要性
确认LDHA Y10磷酸化是否对AKR1B10介导的耐药和糖酵解增强是必需的。
在AKR1B10过表达细胞中敲低LDHA，在AKR1B10敲低细胞中回补LDHA WT或Y10A突变体，检测IC50、凋亡、ATP、葡萄糖、乳酸和ECAR。
临床样本分析AKR1B10表达与预后的关系
探讨AKR1B10表达与仑伐替尼疗效和患者预后的临床相关性。
收集161例HCC患者的肿瘤和癌旁组织，通过IHC染色分析AKR1B10表达，比较PR和PD组差异，并进行生存分析（OS和PFS）。
评估EPA与仑伐替尼联合治疗的协同效应
验证抑制AKR1B10是否与仑伐替尼协同克服体内耐药。
体外检测EPA联合仑伐替尼的凋亡率。建立LR-Huh7和LR-Hepa1-6异种移植模型及PDX模型，给予EPA、仑伐替尼或联合治疗，评估肿瘤体积、重量和分子标志物变化。同时用CRISPR-Cas9敲除AKR1B10验证靶向特异性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | -- | |
| 药物处理 | 仑伐替尼 | Selleckchem | -- |
| MG132 | Selleckchem | -- | |
| 嘌呤霉素 | Selleckchem | -- | |
| 依帕司他 | Selleckchem | -- | |
| 鱼藤酮 | Beyotime | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Beyotime | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | -- |
| 分子克隆 | QuikChange定点突变试剂盒 | Stratagene | -- |
| PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Takara | -- | |
| TBGreen试剂盒 | Takara | -- | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Guangzhou Saicheng Biotechnology | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Millipore | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 增强化学发光检测试剂盒 | Meilunbio | -- | |
| 抗AKR1B10抗体 | Affinity | -- | |
| 抗AARS1抗体 | Affinity | -- | |
| 抗LDHA抗体 | Affinity | -- | |
| 抗p-LDHA (Y10)抗体 | Affinity | -- | |
| 抗HA抗体 | HUABIO | -- | |
| 抗Flag抗体 | HUABIO | -- | |
| 抗His抗体 | HUABIO | -- | |
| 抗Kla抗体 | PTM Bio | -- | |
| 抗H3K18la抗体 | PTM Bio | -- | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | BOSTER | -- | |
| 细胞活性 | CCK-8试剂盒 | Biosharp Biotechnology | -- |
| 凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 代谢检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 葡萄糖检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 乳酸检测试剂盒 | Solarbio | -- | |
| Seahorse | XF96孔板 | Seahorse Biosciences | -- |
| Seahorse XFe96分析仪 | Agilent | -- | |
| Seahorse XF糖酵解速率检测试剂盒 | Agilent | 103344-100 | |
| 免疫共沉淀 | 免疫共沉淀试剂盒 | Absin | Abs955 |
| 快速银染试剂盒 | Beyotime | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | USCN | -- |
| 酶标仪 | Tecan | -- | |
| 药物处理 | L-乳酸钠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与耐药模型建立 | 人肝癌细胞系Hep3B、Huh7、小鼠Hepa1-6、HEK293T的来源和培养条件；耐药细胞系的建立方法（药物浓度递增方案），IC50值。 阅读提示：Materials and Methods 2.3, 2.1, 2.8; Figure 1C |
| 乳酸化位点验证 | AKR1B10 K173乳酸化位点的突变构建（K173R），乳酸化抗体验证，Nala处理浓度和时间。 阅读提示：Materials and Methods 2.3, 2.4, 2.7; Results 3.3; Figure 3F-I |
| AARS1功能验证 | AARS1过表达和敲低的效率，AARS1-5M突变体的构建，CoIP和乳酸化检测。 阅读提示：Materials and Methods 2.4, 2.7, 2.12; Results 3.4; Figure 4 |
| 泛素化实验 | 泛素化检测方法（是否变性），MG132使用浓度和时间，CHX追踪实验的浓度和时间，K63连接特异性的验证。 阅读提示：Materials and Methods 2.12; Results 3.5; Figure 5 |
| LDHA磷酸化与转录调控 | LDHA Y10磷酸化检测，AKR1B10过表达/敲低对LDHA mRNA和蛋白的影响，H3K18la ChIP-qPCR的引物和条件。 阅读提示：Materials and Methods 2.6, 2.7; Results 3.6; Figure 6 |
| 动物实验 | 小鼠品系和来源，细胞注射数量，给药方式（口服灌胃）和频率，给药开始时间，肿瘤测量方法，PDX模型的建立细节。 阅读提示：Materials and Methods 2.13; Results 3.8; Figure 8 |
| 临床样本分析 | 临床样本纳入和排除标准，mRECIST分组（PR/PD），IHC评分标准，生存分析统计方法。 阅读提示：Materials and Methods 2.2; Results 3.7; Figure 7 |
| 统计分析 | 统计检验方法（Student's t-test, one-way ANOVA, Wilcoxon, Kruskal-Wallis, chi-square），数据呈现（mean ± SD），显著性水平（p<0.05）。 阅读提示：Materials and Methods 2.16 |