网络药理学靶点预测
预测CTFs的活性成分及其潜在作用靶点，并筛选与HCC相关的共同靶点。
从TCMSP数据库获取CTFs的27种生物活性成分和318个潜在靶点，从DrugBank、OMIM、DisGeNET获取486个HCC相关靶点，VENNY2.1分析得到70个共同靶点。
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整合网络药理学与实验验证揭示金鸡菊总黄酮（CTFs）作为肝细胞癌潜在治疗药物的作用
Integrated network pharmacology and experimental validation reveal Coreopsis tinctoria Total Flavonoids (CTFs) as potential therapeutic agents against hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含网络药理学预测、分子对接、体外细胞实验（CCK-8、流式、qPCR等）和体内斑马鱼异种移植模型，多个独立证据层级且含功能与机制验证。
主要模型
HepG2人肝癌细胞系 LO2正常人肝细胞系 斑马鱼异种移植瘤模型
重点核对
CTFs处理浓度：50、100、150 µg/mL（体外） CTFs处理时间：48小时（CCK-8、活/死染色、细胞周期） 斑马鱼异种移植模型：HepG2细胞（约200个）微注射入2 dpf AB品系斑马鱼胚胎 斑马鱼CTFs浓度：15.6、31.2、62.5 µg/mL HepG2细胞接种密度：96孔板5×10^3 cells/well，6孔板1×10^5或3×10^5 cells/well
摘要
目的：采用网络药理学与实验验证相结合的综合方法，验证金鸡菊总黄酮（CTFs）的抗肝细胞癌（HCC）功效并探讨其潜在机制，从而支持其作为肝癌多靶点治疗药物的潜力。方法：从传统中药系统药理学（TCMSP）数据库检索CTFs的潜在靶点，从GeneCards、OMIM和DrugBank收集HCC相关靶点。使用VENNY2.1鉴定共同靶点，通过STRING构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。使用DAVID进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。使用Cytoscape构建“CTFs-HCC-靶点-通路”网络以识别关键成分和核心靶点。使用Autodock Vina进行分子对接。通过箱线图可视化关键靶点在HCC和正常组织之间的差异表达，并通过Kaplan-Meier生存分析评估预后相关性。体外实验包括CCK-8、活/死染色、集落形成、流式细胞术、qPCR，用于评估增殖、活力、活性氧（ROS）水平、细胞周期分布和基因表达。建立斑马鱼异种移植模型以确定最小毒性浓度（MTC），并通过荧光成像和HE染色评估肿瘤抑制。结果：网络分析确定了CTFs的27种生物活性成分和318个推定靶点，其中32个与HCC相关。核心靶点包括Caspase-3、P53、MAPK1、Bcl-2和Bax，主要与槲皮素、(-)-表没食子儿茶素（EGCG）、漆黄素、金合欢素、木犀草素和山柰酚相互作用。分子对接证实了这些化合物与核心靶点之间的强结合亲和力。促凋亡基因（Bax、Caspase-3、P53）在HCC组织中上调，Bax/Caspase-3低表达与不良生存相关。CTFs处理进一步增强Bax、p53和Caspase-3的表达，抑制Bcl-2，同时增加Bax/Bcl-2比值。在体外，CTFs抑制HepG2增殖，促进LO2生长，诱导ROS产生、G2/M和S期阻滞以及细胞凋亡。在体内，CTFs显著抑制斑马鱼异种移植瘤的生长。结论：CTFs通过多靶点调节凋亡相关基因和多种信号通路发挥抗HCC作用，有效抑制癌细胞增殖。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 金鸡菊总黄酮（CTFs）是否具有抗肝细胞癌（HCC）作用及其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- CTFs通过上调促凋亡基因（Bax、Caspase-3、P53）并下调抗凋亡基因Bcl-2，升高Bax/Bcl-2比值，诱导ROS积累和细胞周期G2/M和S期阻滞，从而激活内源性凋亡途径，抑制HCC细胞增殖。
- 主要证据
- 网络药理学预测显示CTFs的活性成分（如槲皮素、EGCG、漆黄素等）与核心靶点（Caspase-3、P53、Bcl-2、Bax等）有较强结合；分子对接验证了结合亲和力；体外实验（CCK-8、活/死染色、集落形成、流式、qPCR）证实CTFs抑制HepG2增殖、诱导凋亡和周期阻滞；斑马鱼异种移植模型显示CTFs显著抑制肿瘤增殖；临床数据（TCGA）显示Bax和Caspase-3低表达与HCC患者较差生存相关。
- 研究意义
- 该研究为CTFs作为多靶点、天然产物来源的新型HCC治疗策略提供了理论基础，并有助于新疆特色药用植物资源的可持续利用，但需进一步机制验证和临床评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PPI网络分析与核心靶点筛选
构建共同靶点的蛋白质相互作用网络，并识别核心靶点。
将共同靶点导入STRING数据库构建PPI网络，使用Cytoscape 3.8.2进行拓扑分析，基于DC、BC、CC中位数筛选出32个核心靶点。
GO和KEGG富集分析
分析核心靶点的功能富集和参与的KEGG通路。
使用DAVID 6.8对32个核心靶点进行GO和KEGG富集分析，可视化展示top10 GO项和top20 KEGG通路。
构建网络并分子对接
构建CTFs-HCC-靶点-通路网络，并验证活性成分与核心靶点的结合能力。
使用Cytoscape构建网络，识别高度连接节点（degree ≥ 12），用AutoDock Vina进行分子对接。
临床数据差异表达和生存分析
评估核心靶点在HCC和正常组织中的差异表达及其与预后的关系。
使用GEPIA2分析TCGA和GTEx数据，箱线图比较P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达，Kaplan-Meier生存分析评估预后。
体外细胞活力评估
评估CTFs对HepG2和LO2细胞活力的影响。
细胞以5×10^3 cells/well接种96孔板，不同浓度CTFs处理48h，CCK-8法检测活力。
克隆形成和活/死染色
评估CTFs对HepG2细胞集落形成能力和细胞死亡的影响。
HepG2细胞接种6孔板（1×10^5 cells/well），CTFs处理24h后换液培养14天做集落形成；活/死染色用Calcein-AM/PI评估细胞活力。
Hoechst染色和ROS检测
评估CTFs对HepG2细胞凋亡形态和ROS产生的影响。
HepG2细胞接种6孔板（3×10^5 cells/well），CTFs处理24h，Hoechst染色观察核形态，DCFH-DA探针检测ROS荧光强度。
细胞周期分析
评估CTFs对HepG2细胞周期分布的影响。
HepG2细胞接种6孔板（3×10^5 cells/well），CTFs处理48h，PI染色后流式细胞术分析细胞周期。
凋亡相关基因表达分析
评估CTFs对HepG2细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响。
提取RNA，qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、P53表达，2^-ΔΔCt法计算相对表达量。
斑马鱼异种移植模型
评估CTFs在体内的抗肿瘤作用并确定最小毒性浓度。
CM-DiI标记的HepG2细胞微注射入斑马鱼胚胎（AB株，2dpf），CTFs处理48h，荧光成像评估肿瘤体积，HE染色观察组织学变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 金鸡菊总黄酮 | 新疆金鸡菊生物科技有限公司 | QS650114020007 |
| 细胞培养 | HepG2人肝癌细胞系 | Purose | -- |
| LO2正常人肝细胞系 | Purose | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK-8试剂 | Cytoskeleton, Beijing | -- |
| 活/死染色 | 钙黄绿素-AM | Elabscience, China | -- |
| 碘化丙啶 | Elabscience, China | -- | |
| 集落形成 | 结晶紫 | Elabscience, China | -- |
| 凋亡检测 | Hoechst溶液 | Salarbio, Beijing, China | 10 μg/mL |
| ROS检测 | ROS检测试剂 | Salarbio, Beijing, China | 10 μg/mL |
| 细胞周期分析 | 核糖核酸酶A | -- | -- |
| 碘化丙啶 | Elabscience, China | 50 μg/mL | |
| 流式细胞术 | BD FACSCanto™ II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒（带离心柱） | Omega, USA | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒 | Quantinova, Germany | -- |
| LightCycler 96实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| 斑马鱼异种移植 | CM-DiI红色荧光染料 | Thermo Fisher Scientific, USA | -- |
| 组织固定 | 10%中性缓冲甲醛 | Servicebio, Wuhan | -- |
| 组织包埋 | 石蜡 | Servicebio, Wuhan, China | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 网络药理学分析 | CTFs活性成分筛选阈值（OB≥30%，DL≥0.18）；HCC靶点数据库来源（DisGeNET, OMIM, DrugBank）；PPI网络核心靶点筛选参数（DC≥80, BC≥16.42, CC≥0.71）；分子对接结合能阈值（-7.0 kcal/mol）。 阅读提示：Methods部分：Network pharmacology analysis of the effects of CTFs on HCC 小节 |
| 细胞培养与处理 | 细胞系（HepG2和LO2）及来源；培养基条件（文中未明确说明）；细胞接种密度（CCK-8: 5×10^3 cells/well，6孔板: 1×10^5或3×10^5 cells/well）；CTFs浓度（50, 100, 150 µg/mL）；处理时间（24或48h）。 阅读提示：Methods部分：CCK-8 assay, Assessment of CTFs effects on HepG2 cell viability 等小节 |
| 体外功能实验 | CCK-8试剂来源（Cytoskeleton, Beijing）及孵育时间（2h）；活/死染色试剂（Calcein-AM/PI, Elabscience）及染色时间（15min）；集落形成实验处理时间（24h）及培养天数（14天）；Hoechst染色浓度（10 μg/mL）及时间（10min）；ROS检测试剂浓度（10 μg/mL）及孵育时间（10min）。 阅读提示：Methods部分：CCK-8 assay, Assessment of CTFs effects on HepG2 cell viability, Colony formation assay, Hoechst staining, Assessment of CTFs-Induced ROS production 小节 |
| 细胞周期分析 | HepG2细胞接种密度（3×10^5 cells/well）；CTFs处理时间（48h）；固定条件（70%乙醇，4°C过夜）；RNaseA浓度（100 μg/mL）及处理时间（30min）；PI浓度（50 μg/mL）；流式细胞仪型号（BD FACSCanto™ II）。 阅读提示：Methods部分：Cell cycle analysis of CTFs-treated HepG2 cells by flow cytometry 小节 |
| 基因表达分析 | RNA提取试剂盒品牌（Omega）；cDNA合成方法（文中未明确说明具体试剂盒）；SYBR Green qRT-PCR Kit品牌（Quantinova）；PCR仪器（LightCycler 96）；内参基因（β-actin）；引物序列（见表1）；2^-ΔΔCt计算方法。 阅读提示：Methods部分：Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) analysis of gene expression 小节及Table 1 |
| 斑马鱼异种移植模型 | 斑马鱼品系（AB株）及年龄（2dpf）；细胞标记（CM-DiI）；每胚胎注射细胞数（约200个）；CTFs处理浓度（MTC测定后选择15.6, 31.2, 62.5 µg/mL）；处理温度（35°C）和时间（48h）；每组样本量（n=10）。 阅读提示：Methods部分：Effect of CTFs on tumor proliferation in a zebrafish xenograft model 小节及Table 4 |