菌株分离与鉴定
确认新菌株的身份和基本特性
从巴马小型猪口腔唾液中分离,通过16S rRNA测序和系统发育树鉴定为鼠李糖乳杆菌MS27,并进行革兰氏染色和电镜观察。
Lacticaseibacillus rhamnosus MS27 Potentially Prevents Ulcerative Colitis Through Modulation of Gut Microbiota.
包含菌株鉴定、体外抗菌和代谢分析、DSS小鼠模型、16S rRNA微生物组、转录组及流式细胞术等多层级验证。
DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型(C57BL/6) 鼠李糖乳杆菌MS27菌株
菌株来源:巴马小型猪口腔唾液 动物分组:CON、DSS、LR+DSS(每组8只雄性C57BL/6小鼠) 灌胃剂量:200 μL 1×10^8 CFU/mL MS27,每2天一次 DSS处理:3% DSS饮水7-14天 流式检测脾脏免疫细胞亚群
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确认新菌株的身份和基本特性
从巴马小型猪口腔唾液中分离,通过16S rRNA测序和系统发育树鉴定为鼠李糖乳杆菌MS27,并进行革兰氏染色和电镜观察。
评估MS27的耐酸、生长、糖利用、抗生素敏感性和抗菌活性
测定生长曲线、耐酸能力、API糖发酵、抗生素敏感性和对病原菌的抑制效果。
评估MS27对结肠炎症状的缓解作用
C57BL/6小鼠分为CON、DSS、LR+DSS三组,MS27灌胃14天,DSS处理7-14天,测定体重、结肠长度、组织病理。
分析MS27对肠道菌群多样性和组成的影响
提取粪便DNA,16S rRNA V3-V4区扩增测序,进行alpha/beta多样性、LEfSe等分析。
揭示MS27处理后的宿主基因表达变化
对结肠组织进行RNA-seq,分析差异表达基因和PPI网络。
验证MS27对全身免疫的影响
通过流式细胞术检测脾脏免疫细胞亚群,并检测血清CRP浓度。
检测MS27产生的短链脂肪酸和脂肪酸
培养MS27上清液,用离子色谱检测挥发性脂肪酸和脂肪酸含量。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养与鉴定 | MRS培养基 | -- | -- |
| 菌株鉴定 | 细菌基因组DNA提取试剂盒 | CWBIO | -- |
| MEGA 11.0 软件 | -- | -- | |
| 生化鉴定 | 乳酸杆菌生化鉴定管 | Hopebio | SHBG13 |
| 电镜观察 | S3400N扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol® 试剂 | -- | -- |
| RNA定量 | ND-2000 分光光度计 | NanoDrop | -- |
| 反转录 | RevertAid 反转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EP0441 |
| RT-qPCR | PowerUp SYBR Green 预混液 | Vazyme | Q712 |
| 16S rRNA测序 | E.Z.N.A.® DNA 提取试剂盒 | Omega Bio-tek | -- |
| PCR | T100 热循环仪 | BIO-RAD | -- |
| PCR产物纯化 | PCR清洁试剂盒 | YuHua | -- |
| 文库定量 | Qubit 4.0 荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 16S rRNA测序 | Illumina Nextseq 2000 测序平台 | Illumina | -- |
| RNA-seq建库 | SMART-Seq_V4 超低输入RNA建库试剂盒 | Clontech | -- |
| 流式细胞术 | 小鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒 | Beijing Solarbio | P8860 |
| CytoPeak R1 三激光14色流式细胞仪 | Dakewe Biotech | -- | |
| PerCP/Cyanine5.5 抗小鼠CD45抗体 | Elabscience | E-AB-F1136J | |
| PE/Cyanine7 抗小鼠CD64/FcγRI抗体[X54-5/7.1] | Elabscience | E-AB-F1186UH | |
| Elab Fluor® Violet 610 抗小鼠F4/80抗体[CI:A3-1] | Elabscience | E-AB-F0995T | |
| APC 抗小鼠MHC II抗体[M5/114] | Elabscience | E-AB-F0990UE | |
| FITC 抗小鼠CD206/MMR抗体[C068C2] | Elabscience | E-AB-F1135C | |
| Elab Fluor® Violet 450 抗小鼠CD19抗体 | Elabscience | E-AB-F0986UQ | |
| PE 抗小鼠CD11b抗体 | Elabscience | E-AB-F1081D | |
| CoraLite® Plus 750 抗小鼠CD68兔重组抗体 | Proteintech | CL750-98029 | |
| 代谢产物分析 | ICS 3000 离子色谱仪 | Dionex | -- |
| CRP检测 | 高灵敏度ELISA试剂盒 | Beijing Solarbio | SEKM-0059 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株分离与培养 | 菌株来源(巴马小型猪口腔唾液)、培养条件(MRS培养基、37°C、24-36h) 阅读提示:4.1 菌株来源和鉴定 |
| 动物模型建立 | 小鼠品系(C57BL/6)、周龄(8周)、性别(雄性)、分组、灌胃剂量(200μL 1×10^8 CFU/mL)、频率(每2天一次)、DSS浓度(3%)、处理时间(7-14天) 阅读提示:4.6 动物实验方案和样品采集、Figure 2A |
| 16S rRNA测序 | 引物对(338F/806R)、PCR条件、测序平台(Illumina Nextseq 2000) 阅读提示:4.8 16S rRNA微生物组分析 |
| 转录组测序 | 建库试剂盒(SMART-Seq_V4)、RNA质量要求(OD260/280 1.8-2.2, RIN>6.5, 浓度>10ng/μL)、测序平台(NovaSeq或DNBSEQ-T7) 阅读提示:4.9 真核生物参考转录组分析 |
| 流式细胞术 | 脾脏单细胞制备、抗体组合、仪器(CytoPeak R1)、门控策略 阅读提示:4.10 流式细胞术实验、Figure 5 |
| CRP检测 | 血清分离、ELISA试剂盒(SEKM-0059) 阅读提示:4.12 血清CRP浓度检测 |
| 代谢产物分析 | 培养时间(12h)、样品前处理(1:50稀释、0.22μm过滤)、离子色谱条件 阅读提示:4.11 挥发性脂肪酸和脂肪酸的检测 |