肠道菌群差异分析
比较健康与PEDV感染仔猪的肠道微生物差异，鉴定潜在保护菌群。
对PEDV感染和健康仔猪的空肠内容物进行16S rRNA扩增子测序和宏基因组测序。
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罗伊氏乳杆菌来源的HDCA抑制PEDV复制并减轻病毒引起的仔猪炎症
Lactobacillus reuteri-derived HDCA suppresses PEDV replication while alleviating virus-triggered inflammation in piglets.
实验完整度
高包含体内仔猪模型、体外细胞实验、多组学分析（代谢组、转录组、蛋白质组）及功能验证，明确TGR5和ISG15机制。
主要模型
3日龄长白仔猪（PEDV感染模型） IPEC-J2细胞（猪肠道上皮细胞） LLC-PK1细胞（猪肾上皮细胞）
重点核对
PEDV攻毒剂量为1000 TCID50 罗伊氏乳杆菌口服剂量为1×10^9 CFU/天/头 HDCA口服剂量为10 mg/kg/天 细胞实验HDCA处理浓度为100 μM PEDV感染复数（MOI）为0.1
摘要
背景：猪流行性腹泻病毒（PEDV）导致新生仔猪严重腹泻、呕吐和高死亡率，但目前尚无完全有效的治疗方法或疫苗。尽管肠道菌群移植可以减轻感染后症状，但具体起保护作用的菌株或代谢物及其抗PEDV的作用机制仍不清楚。结果：给三天大的仔猪口服罗伊氏乳杆菌GZ-1或其代谢物猪去氧胆酸（HDCA），可显著缓解PEDV攻毒后的临床症状并提高存活率。这种保护是通过病毒暴露前五天的预处理实现的。两种干预均显著维持了肠道结构，保持正常的绒毛高度和杯状细胞密度，同时显著降低了空肠组织中的PEDV载量。代谢组学分析确定HDCA——罗伊氏乳杆菌代谢产生的次级胆汁酸——是核心保护介质。HDCA对PEDV的直接抗病毒活性随后通过互补的体外和体内实验验证得到证实。整合的转录组学和蛋白质组学分析揭示了HDCA功效的双重机制途径：（1）抑制NF-κB驱动的炎症级联反应，（2）激活干扰素刺激基因15（ISG15）依赖性抗病毒途径。结论：本研究确立了罗伊氏乳杆菌-HDCA-TGR5-IFNβ-ISG15代谢轴作为一种新的抗病毒途径。本研究确定微生物来源的HDCA是一种关键效应代谢物，通过协调抑制炎症和增强抗病毒防御来介导对PEDV的保护。这些发现强调微生物-代谢串扰作为针对肠道冠状病毒的一种有前景的治疗策略，并为共生菌来源的干预措施管理猪流行性腹泻提供了基础证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物及其代谢物是否可以抑制PEDV复制并减轻感染症状？
- 核心机制
- HDCA通过激活TGR5-cAMP轴，诱导IFN-β产生，上调ISG15表达从而抑制PEDV复制；同时抑制NF-κB驱动的炎症反应。
- 主要证据
- 在3日龄仔猪模型中，口服罗伊氏乳杆菌或HDCA显著降低死亡率并减少空肠PEDV载量；体外细胞实验证实HDCA抑制PEDV复制，TGR5激动剂/拮抗剂实验验证了TGR5作用。
- 研究意义
- 建立了L. reuteri-HDCA-TGR5-IFNβ-ISG15代谢轴作为新的抗病毒途径，为肠道冠状病毒的治疗提供了有前景的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
罗伊氏乳杆菌移植效果评估
验证罗伊氏乳杆菌移植对PEDV感染的保护作用。
给3日龄仔猪口服活菌（LLR）或灭活菌（KLR）或MRS培养基，5天后攻毒，监测腹泻和死亡率，并分析空肠病理和病毒载量。
乳杆菌代谢物鉴定
确定罗伊氏乳杆菌产生的关键保护代谢物。
对有无罗伊氏乳杆菌移植的PEDV感染仔猪空肠内容物进行非靶向代谢组学分析，并结合靶向胆汁酸代谢组学验证。
体外抗病毒验证
验证HDCA对PEDV复制的直接抑制作用。
在IPEC-J2和LLC-PK1细胞中，用不同浓度HDCA预孵育后感染PEDV，检测病毒滴度和N蛋白表达。
体内保护效果评估
验证罗伊氏乳杆菌和HDCA在仔猪模型中对PEDV感染的保护作用。
给3日龄仔猪口服罗伊氏乳杆菌、HDCA或DMSO对照，5天后攻毒，监测死亡率、肠道病理和病毒载量。
机制研究
阐明HDCA抗PEDV的分子机制。
在细胞水平，使用TGR5激动剂CCDC和拮抗剂SBI-115，检测cAMP水平、TGR5、IFN-β和ISG15表达；并整合转录组和蛋白质组分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
微生物组分析
病毒滴度检测
细胞功能检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞实验药物处理 | 猪去氧胆酸 | -- | -- |
| SBI-115 | -- | -- | |
| CCDC | -- | -- | |
| ELISA | cAMP ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0056 |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 脱脂奶粉 | BD Difco | -- | |
| 组织染色 | AB-PAS染色试剂盒 | Servicebio | -- |
| 微生物培养 | MRS培养基 | -- | -- |
| DNA提取 | E.Z.N.A.® DNA提取试剂盒 | Omega Biotek | -- |
| 菌落PCR | 细菌DNA提取试剂盒 | Omega Bio-tek | -- |
| PCR | 2× Taq Plus Master Mix II | Vazyme | -- |
| PCR电泳 | Super GelBlue核酸染料 | -- | -- |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Omega Biotek | -- |
| 病毒RNA提取试剂盒 | Omega Biotek | -- | |
| qPCR | SYBR Green染料 | -- | -- |
| TaqMan探针 | -- | -- | |
| 胆固醇检测 | Amplex Red胆固醇检测试剂盒 | Beyotime | S0211S |
| 蛋白消化 | 三(2-羧乙基)膦 | -- | -- |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 蛋白标记 | TMT标记试剂 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol®试剂 | -- | -- |
| 文库构建 | SuperScript试剂盒 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染料 | -- | -- |
| FITC标记二抗 | Servicebio | -- | |
| 组织切片成像 | PANNORAMIC数字切片扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
| 细胞成像 | EVOS FL AUTO成像系统 | -- | EVOS |
| 荧光定量 | Quantus™荧光计 | Promega | -- |
| 测序平台 | Illumina PE300测序平台 | Illumina | -- |
| 宏基因组测序 | NEXTFLEX Rapid DNA-Seq试剂盒 | Bioo Scientific | -- |
| Illumina NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 蛋白定量 | NanoDrop分光光度计 | -- | -- |
| 文库质检 | 生物分析仪 | -- | -- |
| 转录组测序 | Qubit 4.0荧光计 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌群差异分析 | 仔猪日龄（7日龄）、攻毒剂量（1000 TCID50） 阅读提示：Materials and methods, Animals and experimental design, Design 1 |
| 罗伊氏乳杆菌移植 | 仔猪日龄（3日龄）、口服剂量（1×10^9 CFU/天/头）、攻毒时间（处理后第5天） 阅读提示：Materials and methods, Animals and experimental design, Design 2 |
| HDCA保护实验 | HDCA剂量（10 mg/kg/天）、罗伊氏乳杆菌剂量（1×10^9 CFU/天/头）、攻毒剂量（1000 TCID50） 阅读提示：Materials and methods, Animals and experimental design, Design 3 |
| 体外HDCA抗病毒 | 细胞系（IPEC-J2、LLC-PK1）、HDCA浓度（100 μM）、PEDV MOI（0.1）、处理时间（2小时预孵育，感染后24小时检测） 阅读提示：Materials and methods, In vitro treatment strategies with HDCA |
| 机制验证 | TGR5激动剂（CCDC）和拮抗剂（SBI-115）浓度（20 μM）、HDCA浓度（100 μM） 阅读提示：Materials and methods, In vitro treatment strategies with HDCA, Results section |