公共数据集转录组分析
分析KD患者和KD模型小鼠中差异表达基因，识别与炎症和细胞膜相关的关键基因。
对GSE64486（KD患者冠状动脉组织）和GSE141072（KD小鼠心脏组织）数据集进行RNA-seq分析，鉴定DEGs并进行GO、KEGG和GSEA分析，通过交集分析确定CDH13为唯一显著下调的共享基因。
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内皮细胞中T-cadherin缺失通过SOD2/ROS/NLRP3通路介导的细胞焦亡促进川崎病血管损伤
T-cadherin deprivation in endothelial cells promotes vascular injury in Kawasaki disease through SOD2/ROS/NLRP3 pathway-mediated pyroptosis.
实验完整度
高包含公共数据集转录组分析、体外HUVECs细胞模型、体内LCWE诱导KD小鼠模型、siRNA敲低与过表达功能验证及SOD2抑制剂机制验证等多个独立证据层级。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） LCWE诱导的KD小鼠模型（C57BL/6j小鼠） KD患者及健康对照血浆样本
重点核对
HUVECs用LPS（5 μg/ml）或LCWE（5 μg/ml）处理24小时 KD小鼠模型：4周龄雄性C57BL/6j小鼠腹腔注射500 μg LCWE或PBS，第10天取材 T-cad敲低使用siRNA（靶序列5′-CATTGAGGACCAGTCAATT-3′），转染试剂为Lipofectamine RNAiMAX SOD2抑制剂2-ME2处理浓度10 μM，处理时间6小时 所有实验至少重复三次
摘要
川崎病（KD）是一种急性发热性全身性血管炎，与冠状动脉病变和冠状动脉瘤的发生相关。该病的特征是持续的血管炎症和内皮功能障碍，其中细胞焦亡是炎症反应的关键驱动因素。然而，将细胞焦亡与内皮损伤及KD发病机制联系起来的分子机制仍知之甚少。对公共数据集的分析显示，与对照组相比，KD患者和KD模型小鼠心脏组织中T-cadherin（T-cad，CDH13）表达显著降低。体外和体内实验显示，在处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和干酪乳杆菌细胞壁提取物诱导的KD小鼠腹主动脉中，T-cad表达均降低。对siRNA介导的T-cad敲低HUVECs进行的RNA测序分析显示，促炎级联反应和细胞焦亡相关通路相关基因显著富集。Western blot分析进一步验证了与对照组相比，T-cad敲低组中细胞焦亡相关蛋白（包括NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18）的表达上调。这些发现得到了功能实验的支持，表明T-cad敲低组中乳酸脱氢酶释放增加、TUNEL阳性细胞增多以及活性氧（ROS）水平升高。总的来说，我们的结果表明，炎症刺激下调内皮细胞中T-cad的表达，随后降低超氧化物歧化酶2（SOD2）的表达及其酶活性。这导致ROS积累，从而激活NLRP3炎症小体并启动细胞焦亡。因此，T-cad缺失通过激活SOD2/ROS/NLRP3通路诱导HUVECs发生细胞焦亡。这些发现强调了T-cad缺失介导的内皮细胞焦亡在KD发生和发展中的关键作用，为其病理生理学和潜在治疗靶点提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内皮细胞中T-cadherin缺失如何通过细胞焦亡参与川崎病的血管炎症和损伤？
- 核心机制
- 炎症刺激下调内皮细胞T-cad表达，导致SOD2表达和酶活性降低，引起ROS积累，激活NLRP3炎症小体和caspase-1介导的细胞焦亡。
- 主要证据
- 基于GSE64486和GSE141072数据集的转录组分析发现CDH13表达降低；在HUVECs和KD小鼠模型中验证T-cad下调；siRNA敲低T-cad后RNA-seq和Western blot显示促炎及焦亡分子上调，ROS水平升高；SOD2抑制剂2-ME2逆转T-cad过表达的保护作用。
- 研究意义
- 研究揭示了T-cad缺失介导的内皮细胞焦亡在KD发生发展中的关键作用，为理解KD病理生理和寻找潜在治疗靶点提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证T-cad表达下调
验证促炎刺激或KD血浆处理是否降低HUVECs中T-cad表达。
用LPS、LCWE或KD患者血浆处理HUVECs，通过Western blot和qPCR检测T-cad蛋白和CDH13 mRNA表达。
体内验证KD小鼠模型中T-cad表达
验证LCWE诱导的KD小鼠模型中T-cad表达变化。
建立LCWE诱导的KD小鼠模型，通过H&E染色评估血管炎症，免疫荧光检测腹主动脉内皮T-cad表达。
T-cad敲低HUVECs的转录组分析
分析T-cad敲低对HUVECs基因表达谱的影响，特别是促炎和焦亡相关通路。
用siRNA敲低HUVECs中T-cad表达，进行RNA-seq分析，鉴定DEGs，并进行GO、KEGG和GSEA分析。
T-cad敲低和过表达的功能验证
验证T-cad表达变化对HUVECs炎症、焦亡和细胞死亡的影响。
通过Western blot、qPCR检测炎症和焦亡相关分子表达，TUNEL染色和LDH释放实验检测细胞死亡。
氧化应激和线粒体损伤评估
评估T-cad敲低对HUVECs中ROS水平、线粒体形态和氧化应激相关基因表达的影响。
通过DHE染色检测ROS水平，TEM观察线粒体形态，分析RNA-seq数据中与线粒体氧化应激和脂质/能量代谢相关的基因表达。
SOD2表达和酶活性检测
验证T-cad表达与SOD2表达及酶活性的相关性。
在T-cad敲低和过表达HUVECs中，通过Western blot、qPCR检测SOD2表达，用试剂盒检测SOD2酶活性。
SOD2抑制剂验证机制
验证SOD2是T-cad缺失诱导焦亡的关键下游介质。
在稳定过表达T-cad的HUVECs中加入SOD2抑制剂2-ME2，检测炎症和焦亡相关分子表达及ROS水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基（1001，ScienCell） | ScienCell | 1001 |
| 铜绿假单胞菌来源的脂多糖（L9143） | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| LCWE制备 | 干酪乳杆菌（11578） | ATCC | 11578 |
| 乳酸菌MRS肉汤（027312） | HMK | 027312 | |
| 磷酸盐缓冲液（G4202-500ML） | Servicebio | G4202-500ML | |
| 十二烷基硫酸钠（3250GR500） | BioFroxx | 3250GR500 | |
| 核糖核酸酶A（ST579） | Beyotime | ST579 | |
| 脱氧核糖核酸酶I（D8071-25） | Solarbio | D8071-25 | |
| 胰蛋白酶（T8802） | Sigma-Aldrich | T8802 | |
| 动物实验 | C57BL/6j小鼠 | Guangzhou Huiyuanyuan Pharmaceutical Technology Co., Ltd | -- |
| 组织学 | H&E染色试剂（DH0006-500） | Leagene | DH0006-500 |
| 中性缓冲福尔马林（40 g/L） | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗原修复液（K800421-2CN） | Dako | K800421-2CN |
| 牛血清白蛋白（ST023-50g） | Beyotime | ST023-50g | |
| 抗T-cad抗体（DF6598） | Affinity | DF6598 | |
| Alexa Fluor 594偶联二抗（A21207） | Invitrogen | A21207 | |
| DAPI（C1002） | Beyotime | C1002 | |
| 抗荧光淬灭剂（P0126-25 ml） | Beyotime | P0126-25 ml | |
| qPCR | TRIzol试剂（9109） | TaKaRa | 9109 |
| PrimeScript逆转录试剂盒（RR036A） | TaKaRa | RR036A | |
| TB Green Premix Ex Taq II qPCR定量试剂盒（RR820A） | TaKaRa | RR820A | |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶（PG113） | EpiZyme | PG113 |
| PVDF膜（ISEQ00010） | Merck Millipore | ISEQ00010 | |
| 抗T-cad抗体（DF6598） | Affinity | DF6598 | |
| 抗IL-6抗体（TA368826S） | OriGene | TA368826S | |
| 抗IL-8抗体（GB115271） | Servicebio | GB115271 | |
| 抗IL-18抗体（67775S） | Cell Signaling Technology | 67775S | |
| 抗IL-1β抗体（AF5103） | Affinity | AF5103 | |
| 抗裂解IL-1β抗体（AF4006） | Affinity | AF4006 | |
| 抗NLRP3抗体（13158S） | Cell Signaling Technology | 13158S | |
| 抗caspase-1抗体（Ab207802） | Abcam | Ab207802 | |
| 抗裂解caspase-1 (p20)抗体（AF4005） | Affinity | AF4005 | |
| 抗ASC抗体（10500-1-AP） | Proteintech | 10500-1-AP | |
| 抗GSDMD抗体（GB115429） | Servicebio | GB115429 | |
| 抗GSDMD N端抗体（DF12275） | Affinity | DF12275 | |
| 抗SOD2抗体（24127-1-AP） | Proteintech | 24127-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体（AF7018） | Affinity | AF7018 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔IgG（7074S） | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| Western blot发光试剂 | GE Health Care | -- | |
| LDH释放检测 | LDH释放检测试剂盒（E-BC-K766-M-48T） | Elabscience | E-BC-K766-M-48T |
| TUNEL检测 | 一步法TUNEL检测试剂盒（E-CK-A325） | Elabscience | E-CK-A325 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒（CA1420） | Solarbio | CA1420 |
| Hoechst染料（DA0013） | Leagene | DA0013 | |
| SOD2酶活性检测 | 含WST-8的SOD1和SOD2检测试剂盒（S0103） | Beyotime | S0103 |
| TEM | Epon 812树脂 | -- | -- |
| 醋酸铀酰 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| 透射电子显微镜JEM1400Plus | Japan Electron Optics Laboratory | JEM1400Plus | |
| EMSIS VELETA G3 CCD相机 | EMSIS | VELETA G3 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX（13778150） | Thermo Fisher | 13778150 |
| Opti-MEM培养基（31985070） | GIBCO | 31985070 | |
| RNA测序 | RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | NovaSeq 6000 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9.5软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HUVECs分离方法、培养基（Endothelial Cell Medium, 1001, ScienCell）、LPS（5 μg/ml）或LCWE（5 μg/ml）处理24小时、KD血浆处理24小时 阅读提示：Methods: Cell culture; Figure 2 legend |
| KD小鼠模型 | 4周龄雄性C57BL/6j小鼠、腹腔注射500 μg LCWE或PBS、第10天取材、血管炎症评分标准 阅读提示：Methods: KD mouse model and inflammation scores for abdominal aorta arthritis; Figure 2 legend |
| T-cad敲低或过表达 | siRNA靶序列（5′-CATTGAGGACCAGTCAATT-3′）、Lipofectamine RNAiMAX转染、慢病毒感染（Vigene Biosciences） 阅读提示：Methods: siRNA transfection, Lentivirus transfection |
| SOD2活性抑制 | 2-ME2浓度（10 μM）、处理时间（6小时）、在T-cad过表达HUVECs中加入 阅读提示：Results, Figure 7 legend; Methods |
| 检测终点 | LDH释放检测、TUNEL染色、DHE染色检测ROS、SOD2酶活性检测、Western blot和qPCR的指标及内参（GAPDH或β-actin） 阅读提示：Methods: LDH release assay, TUNEL assay, Measurement of ROS levels, Measurement of SOD2 enzyme activity, Western blot analysis, RNA isolation and qPCR |
| 统计分析 | 数据分布正态性检验（Kolmogorov-Smirnov检验）、两组比较用非配对t检验或Mann-Whitney U检验、多组比较用单因素方差分析（Tukey事后检验）、实验重复至少三次、P<0.05有统计学意义 阅读提示：Methods: Statistical analysis |