OPIs的设计与合成
基于hIAPP关键淀粉样生成区域结构，设计并合成O-糖基化肽抑制剂库。
通过固相肽合成法合成SS、SLS、LSLS、SNS和NSNS，经HPLC纯化并质谱表征。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
O-糖基化肽抑制人胰岛淀粉样多肽的聚集和毒性
O-glycosylated peptides curtail the aggregation and toxicity of human islet amyloid polypeptide.
实验完整度
高包含体外生化实验（ThT、TEM、CD、SPR、MST）、细胞实验（MTT、ROS、共聚焦）和离体胰岛模型，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
大鼠胰岛素瘤INS-1细胞 分离的小鼠胰岛 hIAPP体外聚集体系（含阴离子脂质体）
重点核对
hIAPP浓度15 μM 抑制剂SNS与hIAPP的摩尔比（10倍） 阴离子脂质体DOPG/DOPC=3:7 INS-1细胞中hIAPP处理浓度1 μM 小鼠胰岛中hIAPP浓度10 μM
摘要
2型糖尿病（T2D）的一个关键致病途径是胰腺β细胞衰竭，丧失其产生胰岛素和调节血糖的能力。越来越多的证据表明，人胰岛淀粉样多肽（hIAPP）的聚集增加，包括可溶性寡聚体和不溶性原纤维，导致β细胞功能障碍和丢失。在本工作中，设计了一个聚焦的O-糖基化肽库，以靶向hIAPP单体。一个N-乙酰氨基葡萄糖修饰的肽SNS被鉴定为该库中抑制hIAPP纤维化的最有效抑制剂。在β细胞和分离的小鼠胰岛中，SNS处理抑制了hIAPP诱导的氧化应激、细胞毒性和细胞凋亡，从而保护β细胞并保持胰岛功能。因此，这些结果表明，O-糖基化策略将为基于肽的拮抗剂的设计铺平新的道路，并为开发治疗淀粉样蛋白相关疾病的新疗法提供启示。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 设计O-糖基化肽抑制剂是否能够有效抑制hIAPP的聚集和毒性，并探索其作用机制。
- 核心机制
- SNS通过与hIAPP单体结合，增强空间位阻并重新平衡多种相互作用，优先抑制原发成核过程，从而中断hIAPP的聚集。
- 主要证据
- 通过ThT动力学、TEM、CD、SPR和MST证实SNS抑制hIAPP纤维化；在INS-1细胞和小鼠胰岛中，SNS抑制hIAPP诱导的氧化应激、细胞毒性和凋亡，并保护胰岛功能。
- 研究意义
- O-糖基化肽抑制剂有望成为治疗淀粉样蛋白相关疾病（包括2型糖尿病）的新型治疗剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抑制hIAPP淀粉样聚集的筛选与表征
评估OPIs对hIAPP纤维形成的抑制效果，并筛选最有效的抑制剂。
采用ThT动力学实验，比较不同OPIs对hIAPP聚集的影响；通过TEM和AFM观察纤维形态，CD光谱分析构象变化。
定量动力学分析
通过全局动力学拟合揭示SNS抑制hIAPP聚集的微观机制。
使用AmyloFit平台对ThT曲线进行全局拟合，分析初级成核和次级成核速率常数。
种子催化的聚集实验
验证SNS对hIAPP种子延伸和次级成核的抑制效果。
在新鲜制备的hIAPP纤维种子存在下，监测SNS对聚集动力学的影响，并通过TEM观察纤维形成。
细胞保护实验
评估SNS对hIAPP诱导的β细胞毒性的保护作用。
在INS-1细胞中，通过MTT实验检测细胞活力，活/死染色直观观察，DCFH-DA探针检测ROS水平，共聚焦显微镜观察细胞摄取和溶酶体共定位。
离体胰岛保护实验
在分离的小鼠胰岛模型中验证SNS的疗效。
分离小鼠胰岛，用hIAPP和SNS处理，通过TUNEL染色、活/死染色、胰岛素免疫荧光、GSIS实验评估β细胞凋亡、活力、胰岛素含量和分泌功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肽合成 | 二异丙基乙胺 | -- | -- |
| Fmoc-氨基酸 | BO MAI JIE Technology Co., Ltd. | -- | |
| CLEAR-酰胺树脂 | BO MAI JIE Technology Co., Ltd. | -- | |
| ThT动力学实验 | 硫黄素T | Sigma-Aldrich | -- |
| 脂质体制备 | 二油酰磷脂酰胆碱 | TCI | -- |
| 二油酰磷脂酰甘油 | TCI | -- | |
| 肽合成 | 1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇 | -- | -- |
| ThT动力学实验 | Tecan Spark多功能微孔板读数仪 | Tecan Spark | -- |
| TEM | FEI Talos L120C G2透射电子显微镜 | FEI | -- |
| AFM | Bruker Dimension Icon原子力显微镜 | Bruker | -- |
| CD | Jasco CD光谱仪J-180 | Jasco | -- |
| SPR | Biacore T200表面等离子体共振仪 | GE Healthcare | -- |
| MST | Monolith NT.115微量热泳动仪 | NanoTemper Technologies | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 细胞活力检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| ROS检测 | 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | Solarbio | -- |
| 细胞染色 | 溶酶体红色荧光探针 | Solarbio | -- |
| 细胞成像 | Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- |
| 流式细胞术 | BD LSR Fortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| 胰岛实验 | 胶原酶 | -- | -- |
| 胰岛染色 | 抗胰岛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3014 |
| Alexa Fluor 647山羊抗兔IgG | Yeasen Biotechnology | 33113ES60 | |
| TUNEL反应混合液 | UElandy | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 钙黄绿素AM | Beyotime | -- | |
| 碘化丙啶 | Beyotime | -- | |
| 胰岛素含量检测 | 胰岛素ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 脂质体制备 | Avanti Polar Lipids滤膜 | Avanti Polar Lipids | -- |
| 荧光光谱 | F97Pro荧光分光光度计 | Shanghai Lengguang Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ThT动力学实验 | hIAPP浓度15 μM；OPIs浓度10倍；阴离子脂质体DOPG/DOPC=3:7，浓度0.25 mg/mL；ThT与hIAPP摩尔比1:1；DMSO终浓度<0.5%；温度？ 阅读提示：参见Methods 'ThT-based kinetic assay' |
| 细胞毒性实验 | INS-1细胞密度8×10^3细胞/孔；hIAPP浓度1 μM；SNS浓度梯度；处理时间24小时 阅读提示：参见Methods 'Cell viability' |
| ROS检测 | INS-1细胞密度1×10^5细胞/孔；hIAPP浓度1 μM；SNS浓度1-10 μM；DCFH-DA浓度5 μmol/L；处理时间2小时 阅读提示：参见Methods 'Reactive oxygen species detecting assay' |
| 小鼠胰岛实验 | 胰岛每孔30个；hIAPP浓度10 μM；SNS浓度100 μM；处理时间24小时；雄性BALB/c小鼠8-12周龄 阅读提示：参见Methods 'Mouse islet-based assay' |
| GSIS实验 | 低糖浓度1.6 mM；高糖浓度16.7 mM；预处理时间1小时；刺激时间各1小时 阅读提示：参见Methods 'Glucose-stimulated insulin secretion assay' |