构建IgAN细胞模型和动物模型
建立模拟IgAN病理状态的细胞和动物模型，用于后续机制研究。
使用IgA处理HK-2细胞建立细胞模型；使用BSA、四氯化碳、蓖麻油和LPS诱导C57BL/6小鼠建立IgAN动物模型。
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MYC通过HRD1促进MFN1降解影响IgA肾病中的线粒体功能
MYC affects mitochondrial function in IgA nephropathy by promoting the degradation of MFN1 through HRD1.
实验完整度
高包括体外细胞实验、体内小鼠模型、机制验证（CHIP、双荧光素酶、泛素化实验）及多种表型检测，证据层级丰富。
主要模型
HK-2细胞 IgAN小鼠模型（BSA/四氯化碳/蓖麻油/LPS诱导）
重点核对
IgAN细胞模型：HK-2细胞经IgA 100 μg/mL处理24小时 IgAN小鼠模型：C57BL/6小鼠，BSA 600 mg/kg隔日灌胃12周，四氯化碳/蓖麻油皮下注射，LPS尾静脉注射 shRNA敲低效率：sh-HRD1-1、sh-MFN1-2、sh-MYC-2为最佳序列 慢病毒注射：1×10^7 TU尾静脉注射（第8周）
摘要
IgA肾病的特征是IgA和补体C3在肾小球系膜区沉积。近期研究指出线粒体损伤在IgAN的发生和发展中起着关键作用。在IgAN进展过程中，升高的myc促进HRD1的转录，进而诱导MFN1的泛素化，导致线粒体功能障碍。我们发现IgAN中myc和HRD1的表达水平升高。下调HRD1和myc通过促进细胞存活、减少肾损伤和改善线粒体稳态成功减轻了IgAN的进展。此外，我们观察到IgAN中MFN1表达水平降低。MFN1的过表达显著抑制了IgAN的进展，而MFN1的缺失则加剧了IgAN损伤。总之，我们的发现揭示了myc通过促进HRD1转录和诱导MFN1泛素化在调节IgAN线粒体功能中发挥关键作用。这些结果表明，靶向myc/HRD1/MFN1轴可能为对抗IgAN进展提供新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Myc在IgA肾病进展中是否通过调控HRD1和MFN1影响线粒体功能，从而参与疾病发病机制？
- 核心机制
- Myc通过结合HRD1启动子区域促进其转录，HRD1作为E3泛素连接酶诱导MFN1泛素化降解，导致线粒体功能障碍，促进IgAN进展。
- 主要证据
- 在HK-2细胞和IgAN小鼠中，Myc和HRD1表达升高，MFN1表达降低；CHIP和双荧光素酶实验证明Myc结合HRD1启动子；泛素化实验证明HRD1促进MFN1泛素化；MFN1过表达改善线粒体功能并抑制IgAN进展，MFN1缺失则加重损伤。
- 研究意义
- 靶向Myc/HRD1/MFN1轴可能为IgAN提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HRD1在IgAN中的作用
评估HRD1表达变化及敲低HRD1对细胞活力和炎症的影响。
Western blot检测HRD1蛋白表达；shRNA敲低HRD1后，CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡，ELISA检测炎症因子。
鉴定HRD1的下游靶蛋白
寻找HRD1介导IgAN进展的效应蛋白。
通过Ubi Browser预测HRD1相互作用蛋白，RT-PCR和Western blot验证KIF1B、MLLT4和MFN1的表达变化。
验证HRD1对MFN1的泛素化调控
验证HRD1是否通过泛素化促进MFN1降解。
共转染Myc-MFN1、sh-HRD1和HA-Ub，免疫沉淀后Western blot检测泛素化水平，并检测蛋白稳定性。
评估MFN1对IgAN进展的影响
确定MFN1表达改变对IgAN细胞和小鼠肾损伤的影响。
过表达或敲低MFN1后，检测细胞活力、凋亡、炎症因子，以及小鼠肾组织病理变化和肾功能指标。
验证线粒体功能变化
评估HRD1和MFN1对线粒体功能的影响。
使用MitoSOX检测ROS、JC-1检测膜电位、Mito-Tracker标记线粒体、ATPase活性检测。
鉴定Myc对HRD1转录的调控
检测Myc是否结合HRD1启动子并调控其转录。
通过动物TFDB预测转录因子，CHIP实验检测Myc与HRD1启动子的结合，双荧光素酶报告实验验证转录激活。
验证Myc敲低对IgAN进展和线粒体功能的影响
评估Myc敲低对细胞存活、炎症和线粒体功能的影响，并验证HRD1过表达能否逆转。
shRNA敲低Myc后，检测蛋白表达、细胞活力、凋亡、炎症因子、ATPase活性、ROS和膜电位；再共转染HRD1过表达载体观察逆转效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Biosharp | BS350A |
| 细胞凋亡检测 | 膜联蛋白V-FITC/PI溶液 | Kechuangda | KCD-T1004 |
| HE染色 | 伊红溶液 | SHANGHAI ZHANYUN CHEMICAL | 17372-87-1 |
| PAS染色 | PAS溶液 | Solarbio | G1281 |
| Masson染色 | Masson溶液 | Solarbio | G1345 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX红色荧光染料 | YEASON | 40778ES50 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1溶液 | MCE | HY-K0601 |
| 线粒体标记 | Mito-Tracker红色荧光染料 | YEASON | 40741ES50 |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL工作液 | Beyotime | C1098 |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA试剂盒 | Biosharp | BL521A | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 兔抗肌动蛋白抗体 | Servicebio | GB11001 | |
| 兔抗HRD1抗体 | Proteintech | 13473-1-AP | |
| 兔抗KIF1B抗体 | Proteintech | 15263-1-AP | |
| 兔抗MLLT4抗体 | Proteintech | 55102-1-AP | |
| 兔抗MFN1抗体 | Proteintech | 13798-1-AP | |
| 兔抗MYC抗体 | Affinity | AF6054 | |
| 山羊抗兔IgG | biosharp | BL003A | |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | Beckman | CytoFLEX |
| 细胞因子检测 | 人IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H6156 |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0149 | |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0109 | |
| 肾功能检测 | 尿蛋白检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C035-2-1 |
| 肌酐检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C011-2-1 | |
| 尿素检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C013-2-1 | |
| 线粒体功能检测 | ATP酶检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-1 |
| RT-PCR | Trizol试剂 | Biosharp | BS259A |
| 逆转录试剂盒 | Cronda | M1003 | |
| qPCR反应试剂盒 | Cronda | M1004 | |
| CHIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Thermo | MAN0016150 |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因试剂盒 | Promega | E1910 |
| 免疫荧光染色 | 小鼠抗IgA抗体 | proteintech | 60099-1-Ig |
| 兔抗MFN1抗体 | proteintech | 13798-1-AP | |
| FITC标记山羊抗小鼠IgG | -- | -- | |
| Cy3标记山羊抗兔IgG | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| IgAN细胞模型 | HK-2细胞经IgA处理浓度和时间 阅读提示：见Materials and methods, Cell culture部分 |
| IgAN小鼠模型 | C57BL/6小鼠的诱导方案、剂量和给药方式 阅读提示：见Materials and methods, Mice and igan model部分 |
| 基因敲低 | shRNA序列选择 阅读提示：见Materials and methods, Cell culture中的shRNA序列列表 |
| 慢病毒注射 | 慢病毒注射剂量和时间 阅读提示：见Materials and methods, Mice and igan model部分 |
| 泛素化检测 | 质粒转染的浓度和时间 阅读提示：见Materials and methods, Ubiquitination assay部分 |