生信分析鉴定IGF2BP2在ESCC中高表达
筛查ESCC中差异表达基因，验证IGF2BP2表达水平。
利用GSE20347、TCGA、GSE23400和GSE75241数据集分析IGF2BP2表达。
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m6A读取器IGF2BP2通过稳定FOXM1 mRNA介导食管鳞状细胞癌的紫杉醇耐药
m6A reader IGF2BP2 mediates paclitaxel resistance in esophageal squamous cell carcinoma via FOXM1 mRNA stabilization.
实验完整度
中包含细胞增殖、克隆形成、凋亡、糖酵解、RNA-seq/m6A-seq及回补实验，但缺乏动物模型和患者样本验证。
主要模型
ESCC细胞系KYSE30和KYSE150 正常食管细胞系HET-1A 293T细胞（用于病毒包装）
重点核对
细胞系：KYSE30和KYSE150 IGF2BP2敲低效率（shRNA-IGF2BP2-1/2） FOXM1过表达/敲低效率 紫杉醇处理浓度和时长 放线菌素D处理浓度（2 µg/ml或2.5 µg/ml，存在差异）
摘要
食管鳞状细胞癌（ESCC）是中国癌症相关死亡的主要原因之一。对紫杉醇的耐药性显著降低了其治疗效果和预后。无氧糖酵解是癌症进展的关键机制。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IGF2BP2）作为RNA N6-甲基腺苷（m6A）修饰的读取器，在转录后水平确保RNA的稳定性。尽管如此，IGF2BP2在介导ESCC中紫杉醇耐药和无氧糖酵解中的作用和机制仍不清楚。本研究选择了两种ESCC细胞系（KYSE30和KYSE150）。通过功能实验评估细胞增殖和克隆形成能力。通过流式细胞术定量细胞凋亡。通过糖酵解测定确定无氧糖酵解速率。通过放线菌素D处理后逆转录定量聚合酶链反应评估叉头盒M1（FOXM1）mRNA的稳定性。通过western blotting分析蛋白水平。生物信息学分析显示IGF2BP2在ESCC中过表达。此外，IGF2BP2沉默抑制了细胞增殖和克隆形成活性。RNA和m6A测序结果表明FOXM1对IGF2BP2介导的ESCC紫杉醇耐药至关重要。此外，发现IGF2BP2沉默损害FOXM1 mRNA稳定性，减少无氧糖酵解，并减弱紫杉醇耐药性。最后，FOXM1过表达减轻了ESCC细胞中IGF2BP2沉默的影响。目前的研究结果强调了IGF2BP2-FOXM1信号通路在调节ESCC无氧糖酵解和紫杉醇耐药中的重要作用，为未来治疗这种恶性肿瘤提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IGF2BP2在食管鳞状细胞癌中介导紫杉醇耐药和无氧糖酵解的机制是什么？
- 核心机制
- IGF2BP2作为m6A读取器，通过识别m6A修饰稳定FOXM1 mRNA，从而促进无氧糖酵解并降低对紫杉醇的敏感性。
- 主要证据
- RNA-seq和m6A-seq筛选出FOXM1作为IGF2BP2的靶点；IGF2BP2敲低降低FOXM1 mRNA和蛋白水平，加速mRNA降解；FOXM1过表达逆转IGF2BP2沉默对增殖、克隆形成、凋亡和糖酵解的影响。
- 研究意义
- 该研究首次揭示IGF2BP2-FOXM1信号在调节ESCC无氧糖酵解和紫杉醇耐药中的重要作用，为ESCC治疗提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞表型验证IGF2BP2功能
评估IGF2BP2敲低对ESCC细胞增殖、凋亡和紫杉醇敏感性的影响。
在KYSE30和KYSE150细胞中敲低IGF2BP2，进行CCK-8、克隆形成、EdU和流式细胞术检测。
RNA-seq和m6A-seq筛选靶基因
鉴定IGF2BP2调控的下游靶基因。
对IGF2BP2敲低KYSE30细胞进行RNA-seq，对KYSE30细胞进行m6A-seq，取交集筛选。
验证IGF2BP2对FOXM1 mRNA稳定性的影响
阐明IGF2BP2是否通过稳定FOXM1 mRNA来调控其表达。
通过RT-qPCR和WB检测FOXM1表达，并用放线菌素D处理检测mRNA衰减。
FOXM1功能验证
验证FOXM1在ESCC中的致癌作用。
使用siRNA敲低FOXM1，进行CCK-8和EdU实验。
回补实验验证IGF2BP2-FOXM1轴
验证FOXM1是IGF2BP2介导效应的关键下游因子。
在IGF2BP2敲低的细胞中过表达FOXM1，检测细胞增殖、克隆形成、凋亡和糖酵解。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- |
| Opti-MEM培养基 | Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 病毒包装 | psPAX2包装质粒 | -- | -- |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| pLKO.1-puro载体 | -- | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P8230 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 15596026 |
| RT-qPCR | Evo M-MLV逆转录预混液 | Accurate Biotechnology Co., Ltd. | AG11706 |
| SYBR Green预混液Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biotechnology Co., Ltd. | AG11701 | |
| LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0010 |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | -- |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶 | Shanghai EpiZyme Co., Ltd. | PG112 |
| PVDF膜 | Servicebio Co., Ltd. | WGPVDF22 | |
| 高效Western封闭液 | Shanghai Genefist Co., Ltd. | GF1815 | |
| 抗IGF2BP2抗体 | Proteintech Group, Inc. | 11601-1-AP | |
| 抗FOXM1抗体 | Proteintech Group, Inc. | 13147-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech Group, Inc. | 10494-1-AP | |
| 兔二抗 | Proteintech Group, Inc. | SA00001-2 | |
| 增强化学发光试剂 | Shanghai EpiZyme Co., Ltd. | SQ201 | |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂 | MedChemExpress | -- |
| 克隆形成 | 0.1%结晶紫 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| EdU增殖 | EdU溶液 | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | C10310-1 |
| 甘氨酸溶液 | MedChemExpress | -- | |
| Apollo和DNA染色液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- | |
| 流式凋亡 | Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 | Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-CK-A211 |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 糖酵解 | 乳酸检测试剂盒 | Cayman Chemical Company | 600450 |
| RNA-seq | DNase | Accurate Biotechnology Co., Ltd. | AG12001 |
| NanoPhotometer分光光度计 | IMPLEN | -- | |
| Agilent 2100 RNA nano 6000检测试剂盒 | Agilent Technology Co., Ltd. | 5067-1511 | |
| VAHTS Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme Co., Ltd. | NR604-01/02 | |
| Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- | |
| iQ SYBR Green试剂盒 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1708880 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina, Inc. | -- | |
| NovaSeq 6000 S4试剂盒V1.5 | Illumina, Inc. | 20028312 | |
| m6A-seq | Magna甲基化RNA免疫沉淀m6A试剂盒 | MilliporeSigma | -- |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs, Inc. | -- | |
| Illumina HiSeq X Ten测序平台 | Illumina, Inc. | -- | |
| 药物处理 | 紫杉醇 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和传代次数（最多15次） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| IGF2BP2敲低 | shRNA序列、感染MOI（10）、Polybrene浓度（6 µg/ml）、嘌呤霉素筛选浓度（5 µg/ml） 阅读提示：Materials and methods: Cell transfection and lentiviral infection |
| FOXM1敲低 | siRNA序列、转染剂量和时长 阅读提示：Materials and methods: Cell transfection and lentiviral infection |
| mRNA稳定性实验 | 放线菌素D浓度（正文2 µg/ml，图注2.5 µg/ml，存在差异）和处理时间 阅读提示：Materials and methods: Actinomycin D treatment assays; Figure 4 legend |
| 细胞功能实验 | CCK-8细胞接种密度和检测时间点；克隆形成细胞数和培养时长；EdU细胞数和标记时间；流式凋亡细胞密度和染色时间 阅读提示：Materials and methods: CCK-8, Colony formation, EdU, Flow cytometry |
| 糖酵解测定 | 细胞接种密度和培养时间 阅读提示：Materials and methods: Glycolysis assays |