构建MEG3过表达模型并验证其对凋亡的影响
明确MEG3过表达是否影响G. parasuis诱导的3D4/21细胞凋亡。
将MEG3过表达质粒转染至3D4/21细胞后感染G. parasuis，通过qPCR验证过表达效率，CCK-8检测细胞活力，流式细胞术检测凋亡率，qPCR和Western blot检测凋亡相关基因表达。
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长链非编码RNA MEG3通过调控ssc-miR-135/CASP8轴调节副猪格拉菌诱导的猪肺泡巨噬细胞凋亡
LncRNA MEG3 Regulates Glaesserella parasuis-Induced Apoptosis of Porcine Alveolar Macrophages via Regulating ssc-miR-135/CASP8 Axis.
实验完整度
中包含细胞活力、流式凋亡、qPCR、Western blot、双荧光素酶报告实验及回复实验，但缺乏体内动物模型验证，实验层级单一。
主要模型
猪肺泡巨噬细胞系3D4/21 副猪格拉菌血清13型菌株CY1201感染模型 MEG3过表达细胞模型 ssc-miR-135过表达/敲低细胞模型
重点核对
G. parasuis感染MOI为20，处理24小时 MEG3过表达质粒及空载体pcDNA3.1 (+)转染 ssc-miR-135 mimic、inhibitor及其阴性对照 CASP8 siRNA（si-CASP8）及其阴性对照 Z-IETD-FMK浓度20 μM抑制外源性凋亡通路
摘要
副猪格拉菌（G. parasuis）是猪呼吸道常见的致病菌，可引起猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。肺泡巨噬细胞是肺固有免疫的第一道防线，其异常凋亡在G. parasuis的致病过程中起关键作用。长链非编码RNA母源性表达基因3（MEG3）与G. parasuis感染相关，但其机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨MEG3在G. parasuis诱导的猪肺泡巨噬细胞系3D4/21凋亡中的作用及其详细分子机制。本研究发现，MEG3过表达促进G. parasuis诱导的细胞凋亡，并上调关键外源性通路蛋白caspase-8（CASP8）和caspase-3（CASP3）。机制上，MEG3作为竞争性内源RNA，通过海绵吸附ssc-miR-135发挥作用，后者直接靶向并抑制CASP8。因此，MEG3过表达缓解了ssc-miR-135介导的CASP8抑制。功能回复实验证实，ssc-miR-135模拟物或CASP8 siRNA均能逆转MEG3的促凋亡作用。总之，本研究揭示MEG3通过竞争性结合解除ssc-miR-135对CASP8的抑制作用，从而调节G. parasuis诱导的3D4/21细胞凋亡。本研究为G. parasuis的致病分子机制提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MEG3是否以及如何通过调节ssc-miR-135/CASP8轴影响G. parasuis诱导的猪肺泡巨噬细胞3D4/21凋亡？
- 核心机制
- MEG3作为ceRNA竞争性结合ssc-miR-135，解除其对CASP8的抑制作用，从而上调CASP8表达并激活外源性凋亡通路。
- 主要证据
- 基于3D4/21细胞模型，通过过表达和敲低实验、双荧光素酶报告实验、Western blot和流式凋亡检测，证实MEG3通过ssc-miR-135调控CASP8表达并影响凋亡。
- 研究意义
- 研究揭示G. parasuis致病的新分子机制，为理解其感染过程提供理论基础，并为开发防控策略提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证MEG3对外源性凋亡通路的依赖
验证MEG3过表达是否通过外源性凋亡通路发挥作用。
使用不同浓度Z-IETD-FMK处理感染细胞，检测CASP8和CASP3 mRNA水平变化；随后转染MEG3过表达质粒并用20 μM Z-IETD-FMK处理，检测基因表达和凋亡率。
验证MEG3对ssc-miR-135的直接靶向作用
确认MEG3是否直接结合ssc-miR-135。
利用RNAhybrid预测结合位点，构建MEG3野生型和突变型双荧光素酶报告载体，共转染ssc-miR-135 mimic后检测荧光素酶活性；同时检测G. parasuis感染和MEG3过表达下ssc-miR-135的表达。
验证ssc-miR-135对G. parasuis诱导凋亡的调控作用
明确ssc-miR-135在G. parasuis诱导凋亡中的功能。
在3D4/21细胞中过表达或敲低ssc-miR-135后感染G. parasuis，通过CCK-8、流式凋亡、qPCR和Western blot检测凋亡相关指标。
验证ssc-miR-135对CASP8的直接靶向作用
确认ssc-miR-135是否直接靶向CASP8的3'UTR。
利用TargetScan和miRanda预测靶基因，GO和KEGG富集分析；构建CASP8 3'UTR野生型和突变型双荧光素酶报告载体，共转染ssc-miR-135 mimic后检测荧光素酶活性。
功能回复实验验证ceRNA轴
验证MEG3通过ssc-miR-135/CASP8轴调控凋亡。
在MEG3过表达基础上共转染ssc-miR-135 mimic或si-CASP8，感染G. parasuis后检测细胞活力、凋亡率以及CASP8/CASP3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证靶向关系
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 胰蛋白大豆琼脂 | Solarbio | -- |
| 胰蛋白大豆肉汤 | Solarbio | -- | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Sangon Biotech | -- |
| RPMI 1640培养基 | Sangon Biotech | -- | |
| 青霉素-链霉素混合物 | Servicebio | -- | |
| 非必需氨基酸 | Sangon Biotech | -- | |
| 细胞转染 | PolyFast转染试剂 | MCE | -- |
| GP-transfect-Mate转染试剂 | Genepharma | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Jiangsu Cowin Biotech | -- |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- |
| BD FACSAria III流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | pmirGLO载体 | Genepharma | -- |
| 双荧光素酶试剂盒 | Jiangsu Cowin Biotech | -- | |
| RNA提取与qPCR | Trizol RNA提取试剂盒 | Vazyme | -- |
| qPCR | 逆转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| miRNA检测 | SuperStar miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Jiangsu Cowin Biotech | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Epizyme | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Epizyme | -- | |
| PVDF膜 | Abcholal | -- | |
| 脱脂奶粉 | Epizyme | -- | |
| 抗CASP3抗体 | Abmart | #T40044 | |
| 抗Cleaved-CASP3抗体 | Abmart | #T40044 | |
| 抗CASP8抗体 | Abmart | #PK85346 | |
| 抗Cleaved-CASP8抗体 | Abmart | #PK85387 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech Group | #10494-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Epizyme | #LF108 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Ncmbio | -- | |
| 凝胶成像系统 | Servicebio | -- | |
| qPCR | 酶标仪 | Servicebio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养与感染 | 菌株：G. parasuis血清13型菌株CY1201；培养条件：TSA/TSB培养基，添加2% NAD和5% FBS，37°C；感染条件：MOI 20，处理24小时 阅读提示：见2.1节和2.2节 |
| 细胞培养与转染 | 细胞系：3D4/21；培养基：RPMI 1640含10% FBS、青霉素-链霉素、非必需氨基酸；转染试剂：PolyFast（质粒）和GP-transfect-Mate（miRNA/siRNA）；转染时细胞融合度70-90%；转染后换液，培养24或36小时 阅读提示：见2.1节和2.2节 |
| 细胞活力检测 | 细胞密度：每孔2000个细胞（96孔板）；处理：转染后24小时感染，再培养24小时；CCK-8孵育2小时，测450nm吸光度 阅读提示：见2.3节 |
| 流式凋亡检测 | 细胞数量：5×10^5；染色：Annexin V-FITC和PI，室温避光20分钟 阅读提示：见2.4节 |
| 双荧光素酶报告实验 | 报告载体：MEG3-Wt/Mut、CASP8 3'UTR-Wt/Mut克隆至pmirGLO载体；共转染：ssc-miR-135 mimic；检测试剂盒：双荧光素酶试剂盒 阅读提示：见2.6节 |
| qPCR | RNA提取：Trizol试剂盒；逆转录：试剂盒；miRNA cDNA合成：SuperStar试剂盒；内参基因：GAPDH（mRNA），U6（miRNA）；分析方法：2^-ΔΔCt 阅读提示：见2.7节及表1 |
| Western blot | 蛋白提取：RIPA裂解液含蛋白酶和磷酸酶抑制剂；蛋白定量：BCA试剂盒；电泳：12.5% SDS-PAGE；转膜：0.22μm PVDF；封闭：5%脱脂奶粉；一抗稀释比例：CASP3 1:1000，Cleaved-CASP3 1:1000，CASP8 1:1000，Cleaved-CASP8 1:1000，GAPDH 1:10000；二抗稀释：1:8000；检测：ECL试剂盒 阅读提示：见2.8节 |