动物模型建立
构建脓毒症小鼠模型以模拟脓毒症相关脑病
雄性C57BL/6J小鼠随机分配至CLP或假手术组,CLP通过盲肠结扎和穿刺诱导脓毒症。
Peripheral Immune Cell Infiltration in the Hippocampus of Sepsis Mice.
研究包含转录组测序、流式细胞术、免疫荧光、透射电镜等多个独立证据层级,并进行了功能验证(凋亡、细胞因子)和机制验证(hub基因相关性)。
C57BL/6J小鼠CLP模型 海马组织
CLP手术操作:盲肠结扎约1.0 cm,18号针穿刺,术后皮下注射50 mL/kg预温生理盐水及镇痛药 样本量:转录组测序26个海马样本(sham 12,CLP 14),流式、电镜、免疫荧光每组n=3 检测时间点:术后24小时取材 免疫细胞浸润分析:使用xCell软件包,基于人类同源基因集 流式细胞术:脑组织免疫细胞染色,使用特异性抗体(如F4/80、CD11b、Ly6C等)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建脓毒症小鼠模型以模拟脓毒症相关脑病
雄性C57BL/6J小鼠随机分配至CLP或假手术组,CLP通过盲肠结扎和穿刺诱导脓毒症。
获取海马组织用于后续分析
术后24小时,处死小鼠,迅速取出海马组织,液氮速冻后-80°C保存。
全面评估海马组织的基因表达变化,并筛选差异表达基因
提取总RNA,构建cDNA文库,使用Illumina平台测序,经质控和比对后,使用DESeq2鉴定差异表达基因。
评估海马组织中不同免疫细胞的浸润程度
使用xCell软件包计算免疫细胞浸润分数,并通过流式细胞术和免疫荧光验证特定髓系细胞的存在。
验证脓毒症后血脑屏障是否受损,以解释免疫细胞浸润的途径
使用透射电子显微镜观察脑微血管超微结构,并通过免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1的表达。
识别与免疫反应相关的枢纽基因,并探索其与髓系细胞浸润的相关性
通过PPI网络(cytoHubba)、WGCNA和免疫相关生物学过程富集三种方法取交集获得7个hub基因,并通过Western blot验证蛋白表达,再用Pearson相关分析其与免疫细胞浸润分数的关系。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因表达分析 | TRIzol试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 蛋白提取 | 蛋白裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白抑制 | 蛋白酶抑制剂 | Bimake | -- |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | Bio-Rad | -- |
| β-actin抗体 | Cell Signalling Technology | #4967 | |
| caspase-3抗体 | Cell Signalling Technology | #9662 | |
| cleaved caspase-3 (C-caspase-3)抗体 | Cell Signalling Technology | #9664 | |
| 辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔IgG抗体 | Cell Signalling Technology | -- | |
| HRP标记的大鼠IgG抗体 | Cell Signalling Technology | -- | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| ChemiDoc XRS+系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞因子检测 | IL-1b ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 免疫荧光 | CD11c抗体 | Cell Signalling Technology | -- |
| Ly6c抗体 | Abcam | -- | |
| ZO-1抗体 | Abcam | -- | |
| DAPI | Wuhan Servicebio Technology Co. Ltd. | -- | |
| FV3000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 免疫组织化学 | CD45 (Ptprc)抗体 | Proteintech | 20103-1-AP |
| ICAM1抗体 | AiFang Biological | AF0688 | |
| CD18 (Itgb2)抗体 | Affinity Biosciences | DF6896 | |
| NRAMP1 (Slc11a1)抗体 | BOSTER | A02547-3 | |
| CD32 (Fcgr2b)抗体 | Affinity Biosciences | AF04227 | |
| CD64 (Fcgr1g)抗体 | Affinity Biosciences | AF13220 | |
| 电镜 | 透射电子显微镜 | FEI Company | TECNAI G 20 TWIN |
| 流式细胞术 | Human TruStain FcX | BioLegend | 422301 |
| 小鼠抗F4/80 PE | BioLegend | 123110 | |
| 小鼠抗CD206 APC | BioLegend | 141708 | |
| 小鼠抗CD86 FITC | BioLegend | 105110 | |
| 小鼠抗CD11b FITC | BioLegend | 101205 | |
| 小鼠抗Ly6C PE | Elabscience | E-AB-F11200 | |
| 小鼠抗Ly6G PE | Elabscience | E-AB-F11200 | |
| 小鼠抗CD11c FITC | BioLegend | 117305 | |
| 小鼠抗MHC II PE | Elabscience | E-AB-F0990D | |
| ACEA NovoCyte流式细胞仪 | Agilent | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、体重;CLP手术细节(结扎位置、针型号);术后液体复苏和镇痛方案;随机化方法 阅读提示:参见Materials and Methods, Animal Model (2.1) |
| 转录组测序 | 样本量(12 sham, 14 CLP)、RNA提取方法、文库构建细节、测序平台、差异表达分析参数 阅读提示:参见Materials and Methods, mRNA Sequencing (2.3), Transcriptome Sequencing and Data Analysis (2.4) |
| 免疫细胞浸润分析 | xCell软件版本、基因同源转换方法、免疫细胞评分阈值、显著性水平 阅读提示:参见Materials and Methods, Peripheral Immune Cell Infiltration (2.6) |
| 流式细胞术验证 | 组织消化条件(胰酶浓度、时间、温度)、细胞计数、抗体克隆和稀释倍数、门控策略、重复次数(n=3) 阅读提示:参见Materials and Methods, Flow Cytometry (2.12) 和Figure 4C |
| 血脑屏障完整性检测 | 电镜固定、切片参数;ZO-1免疫荧光抗体稀释、图像分析 阅读提示:参见Materials and Methods, Transmission Electron Microscopy (2.11) 和Immunofluorescence (2.10), Figure 4A,B |