鉴定Hal为carviolin A的潜在靶标
筛选与蒽醌类化合物结合的潜在靶蛋白
利用DARTS方法结合转录组分析,鉴定出hal基因及其它六个基因在ΔAn突变体中显著下调,并受carviolin A诱导表达。
Novel Anthraquinone Chlorination Contributes to Pigmentation and ATP Formation in Thermomyces dupontii.
包含基因敲除突变体构建、转录组分析、体外酶催化、代谢物结构鉴定、表型及能量代谢功能验证等多层级实验。
嗜热毁丝霉野生型菌株 Δhal基因敲除突变体 ΔAnO基因敲除突变体 大肠杆菌BL21异源表达系统
hal基因敲除突变体的构建与验证 氯化蒽醌代谢物的化学结构鉴定 37°C低温下ATP含量显著降低 线粒体膜电位和质子水平的变化 NAD+/NADH和NADP+/NADPH比值的改变
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选与蒽醌类化合物结合的潜在靶蛋白
利用DARTS方法结合转录组分析,鉴定出hal基因及其它六个基因在ΔAn突变体中显著下调,并受carviolin A诱导表达。
阐明hal基因对蒽醌氯化及菌落色素沉着的影响
利用CRISPR-Cas9技术敲除hal基因,比较WT和Δhal在不同培养基和温度下的菌落颜色、生长、产孢及抗逆性。
确定hal基因负责的氯化产物结构
通过大规模发酵、色谱分离和NMR、MS分析,鉴定出CA-Cl (2)、二聚体(3)和emodin-Cl (4)等新化合物。
确认Hal蛋白催化carviolin A氯化的功能
将hal基因异源表达于E. coli BL21,纯化Hal蛋白,在体外反应体系中加入底物carviolin A,通过HPLC-MS检测产物2。
探究hal缺失对ATP产生和能量代谢途径的影响
比较Δhal和WT在37°C和45°C下的ATP含量、线粒体膜电位、质子水平、NAD+/NADH、NADP+/NADPH比值及铁离子状态。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白提取 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| 结合实验 | Carviolin A | -- | -- |
| 基因敲除 | p-TrpC-NLS-coSpCas9-NLS质粒 | -- | -- |
| p-tRNA-Gly-sgRNA质粒 | -- | -- | |
| 代谢分析 | Q Exactive Focus质谱仪 | Thermofisher | -- |
| CAPCELL PAK C18色谱柱 | Shiseido | -- | |
| 蛋白表达 | pET28a质粒 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | -- | -- |
| 体外酶活 | 黄素腺嘌呤二核苷酸 | MedChemExpress | HY-B1654 |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Rhawn | 606-68-8 | |
| 过氧化氢酶 | Solarbio | C8070 | |
| 葡萄糖脱氢酶 | Aladdin | H1520116 | |
| 黄素还原酶 | MedChemExpress | HY-P71709 | |
| 氯含量测定 | 氯离子检测试剂盒 | -- | E-BC-K189-M |
| ROS/超氧化物检测 | ROS/超氧化物检测试剂盒 | Abcam | ab139476 |
| 耗氧率测定 | 细胞外耗氧检测试剂盒 | Abcam | ab197243 |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| 线粒体膜电位检测 | DiOC2(3) | Absin | abs42008034 |
| 质子水平检测 | BCECF-AM | Yeasen | 40701ES50 |
| NAD+/NADH检测 | NAD+/NADH检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K804-M |
| NADP+/NADPH检测 | NADP+/NADPH检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K803-M |
| 铁离子水平检测 | 铁检测试剂盒 | Dojindo | I291 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株培养 | 培养基成分、培养温度和天数 阅读提示:Materials and Methods 4.1 |
| 基因敲除 | sgRNA序列、转化方法、筛选标记(hygromycin B浓度) 阅读提示:Materials and Methods 4.5, Table S3 |
| 代谢物分析 | 发酵体积、色谱条件(流动相梯度)、质谱参数 阅读提示:Materials and Methods 4.8 |
| 体外酶活 | 反应各组分浓度、温度、时间 阅读提示:Materials and Methods 4.10 |
| 能量代谢检测 | ATP、膜电位、质子水平检测的样品处理和试剂盒型号 阅读提示:Materials and Methods 4.15-4.19 |